肠杆菌检验程序详细版

1、肠杆菌科【器材】一、SS平板培养基：选择性培养基,有促进目白菌生长的物质和鉴别用指示剂1、煌绿、胆盐、硫代硫酸钠、枸檬酸钠等能抑制G+菌及大多数大肠生长,胆盐促进伤寒生长.2、大肠分解乳糖产酸：中性红6.8红8.0黄变红,与胆盐结合合成胆酸,因而形成中央混浊的深红色菌落,病原菌不分解乳糖,故菌落呈透明微黄色.3、枸檬酸铁能指示硫化氢产生,硫化铁呈黑色4、硫代硫酸钠有缓和胆盐对志贺、沙门菌的毒害作用,并中和煌绿、中性红染料的毒性,使大肠红 色鲜明二、KIA斜面培养基：用酚红作指示剂6.8黄8.4红.上层为固体琼脂斜面,含乳糖.下层为半 固体琼脂,含葡萄糖,含硫酸亚铁.1、细菌如能发酵乳糖和葡萄糖

2、产酸产气,那么斜面及底层均呈黄色,且有气泡.非致病菌如大肠埃 希菌一般既可利用乳糖也可利用葡萄糖,但肺克也是如此.2、如细菌只发酵葡萄糖不发酵乳糖,因 葡:乳为1:10,斜面所产生的少量的酸可因接触空气而氧化 挥发,从而使斜面局部保持原来的红色；底层那么是在相对缺氧的状态下,所生成的酸不被氧化挥发而左：不发酵乳糖,强产硫化氢.中：不发酵乳糖,不产硫化氢.右：发酵乳糖,不产硫化氢保持黄色.致病菌一般不能利用乳糖,可用于区别致病/非致病菌.3、如细菌分解蛋白质产生硫化氢,那么与硫酸亚铁反响生成硫化亚铁黑色沉淀物,使培养基变黑.再在斜面划线.KIA或普通平板或普通平板上的较大菌落,观察纸片颜色的变化

3、,呈蓝如试剂为盐酸二甲基对苯二胺,阳性者那么为红色.肠杆菌科多为阳性但方法：分别穿刺接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌,37 C 孵育 16-18h4、接种方法：先穿刺到底, 【实验内容】一、氧化酶试验原理：见奈瑟菌属局部 操作：取氧化酶纸片,刮去 紫色为阳性,不变为阴性 变形杆菌为阴性.考前须知：因SS培养基中的化学成分和生化反响复杂,其菌落可使滤纸变为紫红色,故对肠道杆菌进行触酶和氧化酶试验时,宜从普通平板或KIA斜面上取菌,以保证试验结果正确.二、动力试验： 原理：有动力的细菌在半固体培养基中沿穿刺线扩散生长.:半固体培养基 结果：穿刺线扩散,培养基透明度减低为动力阳性；穿刺线清楚,培养基透明

4、为动力阴性.本试验, 大肠为+,肺杆为-三、呷噪试验：靛基质试验原理：有些细菌具有色氨酸酶,能分解蛋白陈中的色氨酸生成口引喋,与对二甲基氨基苯甲醛形成红色 化合物.培养基：蛋白月东水方法：将大肠埃希菌和伤寒沙门菌分别接种于蛋白月东水培养基中,37 C孵育16-18h结果：取出后,滴加口引喋试剂 2d,混匀,可见培养物上层呈玫瑰红色为+,不变色为-.本试验,大肠为+,伤寒为-四、尿素酶试验：原理：产生尿素酶的细菌能分解尿素,形成氨,使培养基呈碱性,酚红指示剂变成红色.培养基：尿素培养基方法：将大肠埃希菌和变形杆菌分别接种于尿素培养基中,37 C孵育16-18h结果：培养基变红色者为阳性.变黄为阴

5、性.本试验,大肠为-,变形为+五、甲基红试验：原理：某些细菌分解葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸可进一步分解为甲酸、乙酸等,故培养物pH在4.5以下,参加甲基红指示剂后呈红色.有些细菌分解葡萄糖产生的酸进一步转化为其它物质,如醇、酮 等,培养基pH在6.2以上,参加甲基红指示剂呈黄色. 培养基: 葡萄糖蛋白月东水方法：分别接种大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌结果：参加甲基红指示剂 2d,混匀,红色为阳性,黄色为阴性.本试验,大肠为+,肺杆为-六、苯丙氨酸脱氨酶试验：原理：某些细菌如变形杆菌属,可产生苯丙氨酸脱氨酶,使苯丙氨酸脱氨生成苯丙酮酸,参加三 氯化铁试剂与苯丙酮酸螯合后形成绿色化合物.培养基: 苯丙氨酸

6、琼脂培养基方法：分别接种大肠埃希菌和变形杆菌,37 C孵育16-18h结果：滴加100 g/L三氯化铁试剂,出现绿色为 +,不变为-.本试验,变形为+,大肠为- 七、柠檬酸盐利用试验：原理：当细菌可以利用钱盐作为唯一的氮源,同时利用柠檬酸钠作为唯一碳源时,可在柠檬盐培养基 上生长,并分解柠檬酸盐为碳酸盐,使培养基变碱,指示剂澳麝香草酚蓝由绿色变为深蓝色,为柠檬 酸盐利用试验阳性.假设不能利用那么不能生长,培养基不变色,为阴性.培养基: 西蒙柠檬酸盐培养基方法：分别接种大肠埃希菌和变形杆菌,37 C孵育16-18h结果：大肠-绿色,变形+ 蓝色八、总结：结果判断与观察KIA :观察上部和下部的颜

7、色变化,变黄为产酸,变红为产碱,有气泡为产气,有黑色为产硫化氢.动力M:半固体上沿穿刺线生长,周围清澈,为阴性,周围混浊者为阳性.口引喋I:在蛋白月东水中滴加靛基质试剂2-3滴,马上变红者为阳性,不变为阴性.尿素酶13t验U:变为深粉红者为阳性,不变或变黄者为阴性.甲基红试验Mr:在葡陈水中滴加甲基红试剂 2-3滴,变红为阳性,变黄为阴性.枸檬酸盐利用试验C:细菌在上生长,颜色变为蓝色为阳性,细菌不长或培养基颜色不变为阴性.苯丙氨酸酶试验：在斜面上滴加1 0 % F e C 1 3试剂2 3滴,变成暗绿色为阳性,不变为阴性.菌种KIAMIU甲基红Mr 枸檬酸 盐C苯 丙 氨 酸斜面底层产气硫化

8、氢动力口引喋月尿酶大肠埃布国AA+-+-+-福氏志贺菌KA-/+-+/-+/-宋内氏志贺菌KA-/+-+-+/-伤寒沙门氏菌KA-+/-+-+/-甲型副伤寒菌KA+-/+-+-乙型副伤寒菌KA+-+-肺炎克雷伯菌AA+-+-+-变形杆菌KA+/-+【其他试验】一、大肠埃希国1、形态结构观察：革兰阴性、中等大小、两端钝圆、多呈单个散在分布的杆菌.鞭毛染色为周毛菌2、菌落观察：在普通琼脂平板上呈圆形、灰白色、湿润、光滑型菌落；在血琼脂平板上呈圆形、灰 白色、湿润、光滑型菌落,某些菌株有3溶血；在SS琼脂平板上呈红色、圆形、凸起、边缘整洁的菌落,多数为光滑型菌落.二、志贺菌属1、形态结构观察：为格兰

9、阴性杆菌,散在分布,多无鞭毛2、菌落观察：在 SS和MAC平板上形成无色透明、中等大小的菌落,除宋内氏志贺菌外,菌落均为 光滑型.3、血清学试验：凡生化反响符合志贺菌属者均需做血清学鉴定.方法：取一环志贺菌四种多价血清与载玻片一端,再取少许待测菌与之混合,同时在玻片另一端取待测菌与之混合,同时在另一端取待测菌与生理盐水混合对照.结果判定：对照呈均匀浑浊,待检菌与志贺菌四种多价血清混合后,数分钟内出现肉眼可见的颗粒 状凝集物即为阳性.继之用 A/B/C/D群最常见的单价血清凝集定种.志贺氏菌屈I他清凝集四种多价血清NS对照1凝集福氏多价期清凝集宋内氏多的血清凝集福氏志贺菌宋内志贺菌报告：别离培养

10、未见可疑菌落或经鉴定不符合志贺菌属鉴定依据者可报告“未别离到志贺菌属细菌.经别离鉴定后符合鉴定依据者,可报告“别离出XX志贺菌,假设进一步做多种生化反响及因子血清分型后,可报告“别离出XX志贺菌X型.二、伤寒沙门菌属1、形态结构观察：沙门菌属为革兰阴性细长杆菌,鞭毛染色可见周鞭毛.2、菌落观察：在 SS和MAC平板上形成无色、半透明、光滑湿润、凸起的小菌落,产硫化氢的菌种 可在SS平板上形成中央带黑褐色的小菌落.3、血清学试验：假设生化反响及形态学检查疑为沙门菌,可选用沙门菌的多价诊断血清进行玻片凝集 试3i .方法：首先选用 AF组多价“ O诊断血清做玻片凝集试验.在试验时以生理盐水作对照.

11、本试验在510 min内不出现凝集者可确定为阴性.但假设生化反响比拟典型,应考虑选用Vi凝集试验,假设凝集,那么用无菌生理盐水将菌洗下,制成浓厚的悬液,100c加热30min,再与AF组多价“ O诊断血清做玻片凝集试验.假设与 AF组多价“ O血清发生凝集,应再与沙门菌单价因子血清分别做玻片 凝集试验,以确定该菌株属于哪一组.一般先选用本地区检出率最高的菌型的相应血清做玻片凝集.假设已确定哪一沙门菌种后,再分别先用H因子血清检查第I相抗原,然后检查第 II相抗原,最后确定该菌种属于哪一型沙门菌.沙门菌属血清学凝甸A-F多价“0"血清(NS对照)凝集 单价血清群ABCDE菌体抗原(O)

12、24793鞭毛抗原(H)abcde菌种甲型副伤寒(PA)乙型副伤寒(PB)丙型副伤寒(PC)伤寒沙门菌鸭沙门菌报告：别离培养未见可疑菌落或经鉴定不符合沙门菌属细菌者,可报告“未别离出沙门菌.生化反响符合沙门菌,玻片凝集试验阳性者,可初步报告为“别离到XX沙门菌或“ X群沙门菌.三、肺炎克雷伯菌1、形态结构观察：为无芽抱格兰阴性杆菌,呈卵圆形或球杆状,常呈双排列,无鞭毛.2、菌落观察：在血琼脂平板上形成圆形、凸起、灰白色、不溶血、光亮的大菌落,相邻菌落易于融合,黏液状,假设用接种针蘸取呈长丝状拽起.在MAC平板上呈乳糖发酵产酸的菌落,即红色、较大、浑浊、凸起的粘液型菌落,较大肠埃希菌大.与大肠埃希菌鉴别IMViC大肠埃布国+-肺炎克雷伯菌-+四、变形杆菌1、形态结构观察：为革兰阴性杆菌,两端钝圆,有明显多形性,在一定条件下可形成球杆状或丝状；无芽抱和荚膜,鞭毛染色为周鞭毛.2、菌落观察：在营养琼脂平板上呈波纹状迁徙