质粒构建流程

1、质粒构建流程一、引物设计1取得目的基因序列,可选用数据库NCBI2软件分析目的基因可用酶切位点.使用 primer5分析出序列不包含的酶切位点,即为可用没切位点.3选择载体.根据转染细胞和实验室资源,选择适宜载体.如 pcDNA3.1+,4选择酶切位点.对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点,选择二者共有的作为备选.载体上两个 酶切位点的距离应有几十bp以上,选实验室常用酶切位点.5使用primer5设计目的基因引物,目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基.6根据选择的酶切位点,查找对应的酶切位点保护碱基,将对应片段添加到设计的引物两端,注意酶切位点 的前后顺序.一般选择三个保护碱基.7引

2、物设计完成,送公司合成.二、目的片段获取1. RNA提取试剂盒：Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒 离心柱型裂解液 RL 4C、漂洗液 RW -20 C保存 准备：冰盒、4 c预冷离心机、EP管2套、吸附柱 RA 一套 操作步骤1将1000 d裂解液RL参加细胞中,混合 5min, 2加200 口氯仿混合,震荡15s,室温孵育3min3 4C, 12000rpm 离心 10min.4最上层水相转移至新EP管中体积约550 口5参加1倍体积550 l 70%乙醇,混匀6全部转移到套收集管的吸附柱RA中,4C, 10000rpm离心45s7弃废液,重套收集管,力口 500 d去蛋白液 RE,

3、 12000rpm离心45s8弃废液,重套收集管,力口 700 d去漂洗液RW, 12000rpm离心60s9弃废液,重套收集管,加 500 d去漂洗液RW, 12000rpm离心60s10弃废液,重套收集管, 12000rpm空离2min11吸附柱放入新 EP管,力口 50 口 RNase free water于膜上,室温放置 2min 12 4C, 12000rpm 离心 60s 13点样：5mRNA+ 1川10 x buffer, 1.5%琼脂糖凝胶电泳,100V , 3min,可见3条亮带14 -20C保存2. RNA反转录试剂盒：TaKaRa primescript RT reage

4、nt kit with gDNA eraser -20 C保存准备：冰盒,取出解冻,为酶不可取出,预冷离心管操作步骤：1基因组DNA去除10 d体系 5 x gDNA eraser buffer2 川 gDNA eraser1 JTotal RNA4 M可根据 RNA 浓度调整 RNase free water3 4PCR仪中进行,程序： 42C, 2min-4c注：RNA的量可根据浓度调整,混合液冰上配制,酶最后参加2反转录反响20 d体系 5 x primerScript buffer 24 J primerScript RT enzyme mix I 1 RT primer mix1 R

5、Nase free water41反响液10 1PCR 仪：37C, 15min - 85 C, 5sf4 c注：可直接将第 2步反混合液好后参加到第1步反响液中3） 1.5mlEP管收集,-20 C长期保存3. PCR扩增高保真酶primerstar扩增,50l体系如下：5 x PS buffer10 MPCR程序：dNTP4 M95 c5min 、dH2O32.5 注95 c30s卜Primerstar0.5川56 c30s J35cyclecDNA1 M3 艾72 c1minR-primer1m72 c10minF-primer1 d注：可根据不同基因调节退货温度,延伸时间,循环点样：5

6、口 PCR产物+ 1川6 x buffer, 1.5%琼脂糖凝胶电泳,100V, 15min4. PCR产物纯化1液相纯化产物电泳结果只含目的条带试剂盒：Microelute cycle-pure spin protocolOMEGA bio-tek D6293-01 将PCR产物参加1.5mlEP管,参加5倍体积buffer CP ,混匀. 转移至 HiBind MicroElution DNA 柱套收集管,室温离心10000g, 1min. 弃废液,力口 700 口 DNA wash buffer 含乙醇到柱子,室温离心10000g, 1min.弃废液,重复 弃废液,空管离心13000g,

7、 1min 柱子放入新 EP管,力口 10-20 N Elution buffer到膜上,室温孵育 3-5min ,离心10000g , 1min电泳检测2割胶回收产物电泳结果含杂带将含目的条带的琼脂糖凝胶切下切得尽量小,放入 1.5ml EP管.2min 加等体积1g=1ml binding buffer XP2 ,60C金属浴7min左右至胶溶解溶液为淡黄色,混匀 溶液参加离心柱,离心 10000g, 1min,废液倒回再离一次 弃废液,力口 300 口 binding buffer XP2,离心 10000g, 1min 弃废液,力口 700 口 SPW washing buffer ,

8、离心 10000g, 1min重复 空管离心13000g, 2min,弃废液,柱子转移到新EP管参加30-50川elution buffer于膜上,室温孵育 1min,离心13000g, 1min电泳检测三、双酶切30川反响体系如下:PCR纯化产物15注Vector12注10X M/L/K buffer3 M10 x M/L/K buffer3 d3dH2O10川3dH2O13 M酶A1 d酶A1 d酶B1 l酶B1m反响条件：takara酶30c水浴1hf65 c金属浴10min终止反响注：buffer类别依使用的酶具体选择,见附表四、连接1双酶切后,可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2 口2酶

9、切产物液相纯化3） 20川连接体系皆可PCR 产物6.3 dpcDNA3.10.7 口10XT4buffer2 dPCR产物5川pcDNA3.12口10XT4buffer2 dT4 ligase13dH2O10"PCR仪中进行：22C, 30min-4 c冰箱过夜注：连接产物-20 C可长期保存五、转化准备：碎冰,灭菌 EP管、LB空液体培养基,带抗性培养板,超净工作台,移液枪,水浴锅加热42 c1将感受态细胞置于冰上,待其融化2超净工作台中,将连接产物10注参加100 口感受态细胞,或质粒 1-3 口参加100川感受态细胞3轻混匀,冰浴 30min4热击水浴 42C, 45s,冰浴

10、1min5力口 900 口 LB 空培养基,摇菌 150rpm, 37C, 1h6浓缩离心13000rpm, 1min,上清液留约 200 d重悬菌体,局部涂板50-100 口7完全吸收后,37 c倒置培养12-16h六、菌落PCR1以rTaq酶50川体系配制PCR反响液,每个 PCR管分装15/,体系如下：3dH2O35.7 dPCR程序：10 x buffer5 d95 c5minMgC123 d95 c30s dNTP4 d56 c30s1 35cyc1erTaq0.3 d72 c1min JR-primer1 M72 c10minF-primer1 ul注：程序与DNA扩土山-样2灭菌

11、牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下,再在新板划板注意编号,每板挑10个菌.新划的板 37 c倒置培养12-16h.3琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,记录含目的条带的菌落号备用.七、测序1 .摇菌1） PCR检测有目的条带的菌落,挑选 2-3个较好的以供摇菌2三角瓶中分装10ml LB抗性液体培养基3用10心1枪头挑起选择的菌落打到培养基中4） 37C.250rpm 摇菌 12-16h2 .送样每瓶取1ml ft液,送华大基因测序3 .比对将测序结果与基因序列进行比对,比对正确那么构建成功,比对错误那么重新构建.注：数据库中基因序列可能有误,假设出现少数突变,可换其他数据库比对试试八、菌种保存菌种

12、比对成功,那么可保存菌种备用.1超净工作台中取 1.5m1EP管,力口 200 口 80%灭菌甘油.2再参加800m管液,轻混匀.3液氮冻存.一个基因冻2管即可九、质粒提取菌种比对成功,冻存菌种后,管液用于提取质粒.试剂盒：AXYGEN axyprep plasmid miniprep kit 250-prep操作步骤：1取3-5ml fi液,室温下离心 10000g, 1min2弃上清,力口 250 口 solution I/ RNase A 重悬菌落,混匀3加250 口 solution II ,倒置轻混匀,孵育 2min.整个裂解反响不超过5min 4参加250 口 solution I

13、II ,立即倒置混匀,直到生成白色絮状沉淀.5室温离心 13000g, 10min6上清液小心转入 HiBind miniprep column 有套管,室温离心 10000g, 1min7弃废液,加 500 口 buffer HB ,室温离心 10000g, 1min8选择性步骤：重复第 7步9弃废液,空管室温离心13000g, 2min10柱子转入新 EP管,力口 30-50 d elution buffer或3dH20到膜上,室温孵育 1-2min11室温离心 13000g, 1min12提取的质粒-20 C保存备用附：感受态制备方法皆采用LB空白培养基：1 .菌种活化1用接种环直接取冻

14、存的E.coli/ DH5 a菌种,在LB平板上划线,37 c倒置培养16h2挑单菌落转到 2-10ml LB液体培养基中,摇菌37 C, 250rpm , 12-16h3取1ml管液参加到100ml LB液体培养基,摇菌 37C, 250rpm , 3h4检测管液 OD600V 0.5 0.3-0.42 .感受态制备准备：0.1M CaCl2灭菌,50ml离心管灭菌,冰水, 1.5ml离心管冰上预冷,离心机 4c预冷. 步骤：1将if液用 50ml离心管分装,调平, 4c离心3000rpm , 8min2弃上清,0.1M CaC12 10ml重悬冰水中进行,动作轻,两管合成一管3冰上放置一段时间,4c离心2500rpm, 8min4弃上清,0.1M CaC1210ml重悬,4c冰箱过夜沉淀5上清液取出8ml,剩2ml,力口 670 d 80%甘油管液：80%甘油=3:1 ,轻混匀6 1.5mlEP管分装,每管分装100 d ,液氮冻存.试剂配制:1 .琼脂糖凝胶1.2%琼脂糖粉0.6g2 义 TAE50ml微波炉加热溶解,冷却一会儿后参加1 d gold view核酸染料,混匀,倒板3 .电泳缓冲液 T