实验十一 聚合酶链式反应ppt课件

1、实验十一实验十一 聚合酶链式反响聚合酶链式反响PCRPCR 和随机扩增多态性和随机扩增多态性DNADNARAPDRAPD实验目的实验目的 学习和掌握PCR实验原理和技术。了解RAPD的原理，学会运用RAPD进展遗传分析。 实验原理实验原理 聚合酶链式反响polymerase chain reaction，PCR的原理是类似DNA天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡聚核苷酸引物，经高温变性、低温退火和中温延伸3个阶段，假设干个循环后，DNA扩增2n倍。普通经过2530个循环后DNA可扩增106109倍。 随机扩增多态性DNARandom Amplification Pol

2、ymorphic DNA是建立在PCR技术之上的一种分子标志方法，它是以一系列不同随机陈列的寡聚核酸单链为引物，对于所研讨的基因组DNA进展扩增，扩增产物经过聚丙烯酰氨凝胶或者琼脂糖凝胶电泳分析，经EB染色来检测扩增产物的多态性。对于任一特定的RAPD引物，它同基因组DNA序列有特定的结合位点，这些位点在基因组某些区域内的分布符合PCR反响的条件，即随机引物在模板的两条链上有互补的位置，且引物的3端相距在一定的长度范围之内，就可以扩增出来DNA片段，假设基因组在这些区域发生DNA的片段的插入或者缺失，或者碱基突变就可以导致这些特定结合位点分布发生变化，而使PCR产物添加或者减少，发生分子量的变

3、化，经过对于PCR产物的检测分析即可以测出基因组在这些区域的多态性。 实验资料实验资料 三种山茶花DNA模板器具和药品器具和药品 PCR管，PCR热循环仪，移液枪，吸头，琼脂糖电泳系统，凝胶成像仪；4种dNTP，引物，Taq聚合酶，Buffer，MgCl2，DNA Marker，琼脂糖。 实验步骤实验步骤 1、反响体系配制采用三种山茶花DNA作为模板，分别用5种RAPD随机引物进展PCR扩增。先在PCR管配制20ul的反响体系：反应物反应物母液浓度母液浓度PCR体系浓度体系浓度加入量加入量模板DNA（不同）100 ng/ul100 ng1.0 ul缓冲液Buffer1012.0 ul4种dNT

4、P混合物10 mmol/L500 umol/L1.4 ulMg Cl225 mmol/L1.4 mmol/L1.2 ulTaq DNA聚合酶5unit/ul1unit0.2 ul引物Primer（不同）10 umol/L0.5 umol/L1.0 ul无菌双蒸水12.2 ul2、PCR扩增将配好PCR管装入PCR热循环仪进展扩增，扩增程序：93预变性4min；93变性4min35退火1min72延伸2min，共45个循环；72延伸10min。3、电泳汲取7 ul PCR产物、2 ul溴芬蓝载样缓冲液，加样到1.2 %琼脂糖凝胶上，5v/cm电泳1h后，在凝胶成像仪中察看电泳谱带，并照相记录。4

5、、数据处置与统计分析用“1(有) 和“0(无) 记录谱带，把图形资料转换成数据资料。根据Jacard类似系数法，求得种类i 和j 之间的遗传类似性系数(F)，再根据D=1-F, 用SPSS软件进展聚类分析，构建分子进化系统树，进展遗传多样性和遗传关系分析。作作 业业做好实验记录，计算各种类之间的遗传类似性系数(F)，并用软件做出聚类分析图。分析山茶花的遗传多样性，和三种山茶花之间的遗传关系。表 2 山茶花RAPD分析中10个有效引物及其序列和扩增结果Tab.2 Ten valid arbitrary primer, its sequence and PCR results in RAPD of

6、 Camellia japonica L. 引 物Primer序 列Sequence扩增条带数Number of bands多态性条带数Number of polymorphic bands多态性百分比(%)Percentage of polymorphic bandsS1GTTTCGCTCC15853.3S2TGATCCCTGG6233.3S4GGACTGGAGT8562.5S6TGCTCTGCCC9333.3S7GGTGACGCAG9222.2S10CTGCTGGGAC6350.0S11GTAGACCCGT5240.0S12CCTTGACGCA6583.3S184CACCCCCTTG878

7、7.5S185TTTGGGGCCT6466.7Total784152.6Average7.84.152.6表 4 六个山茶花品种间的遗传距离距阵Tab.3 Genetic distant matrix of six-variety Camellia japonica L.编 号Number品 种Variety1234561American Dahong*2Fendan0.2500*3China-America Hong0.09090.2143*4Feizhua Furong 0.15790.24140.1754*5Yudan0.23810.08410.20000.2844*6Hua Feizhua Furong 0.19270.26130.22940.07960.26