神经元原代培养

1、神经元原代培养一、准备1 试剂1）胎牛血清灭活：血清室温自然融解，摇匀。选用与血清瓶同规格的对照瓶一个， 并加入与血清等体积的水。对照瓶内插入12支温度计（保证测试温度的准确 性）。将血清瓶与对照瓶同时放入恒温水浴箱，待温度计所示温度上升至56C时，定时30分钟。灭活后分装7 0ml/瓶，一瓶放在培养箱做无菌实验，其余-20- 70 0c保存。2） DHank's液（g/L） ： NaCI: 8, KCI: 0.4, KH2Po4: 0.06, NazHPO42H2O: 0.06, NaHCOa： 0.35;酚红：0.02,超纯水溶解，调节PH至7.2,高压灭菌（购自南方医 院临床试验

2、中心）。3）多聚赖氨酸：避光，用超纯水配制好后过滤,200 或400 3 l/tube分装20度 储存。母液浓度为5mg/ml，工作液浓度为0.1mg/ml （购自Sigma,P2636,100mg）。配置方法：20ml超纯水溶解，分装为1ml/管。用时加入49ml超 纯水稀释为。1 mg/ml的工作液。4） 50mM谷氨酸：超纯水溶解，滤过除菌，分装50 13 l/tube -20C保存。使用时需 将终浓度调整为25讪（购自Sigma, G8415, 100g，分子量：147.13）。配制 方 法：电子天平称量谷氨酸1.47139,即0.01!71。1=100101。1,溶于20。011超纯

3、水中配制 为50mM的谷氨酸母液。例：500ml 的 Neurobasal Medium 中力口人 Glutamate 母液（50mM） 250 P，此时终浓度约为25八M。5） 胰蛋白酶：0.25% （购自 Hyclone, SH30042.01, 100ml）。6）阿糖胞甘（AraC）母液：10mM,（阿糖胞甘，1 ： 1000稀释用）（购自 Sigma, C1768, 100mg，分子量：243.22）;配制方法：100mg/243.220.41mM、 加入41 ml超纯水溶解，配制成10mM的AraC母液。AraC工作液：10八M （半量换液，终浓度5八M ）;7 ） DNAsel（）

4、（购自 ROCHE, 100mg, 1mg=2000U,用 dWO 配成 10mg/ml 母 液，过滤分装100 p |/tube每次使用50-100 pl）Q拉餐甘8 ）培养基FBSDMEM/F12 ：购自 Hyclone，SH30023.01B，500ml双抗：购自GIBCO - 100mlNeurobasalMedium-A：购自 G旧CO,（新生鼠）或（孕鼠）500mlB27：购自 GIBCO, 17504-044, 10mlGlutamax-100X：购自 GIBCO, 3505061, 100ml 分离培 养基：10%FBS+DMEM/F12+双抗 培养用 Start Medium

5、： Neurobasal Medium-A 500ml+B27 10ml+Glutamax-100X 5ml+ Glutamate 25 换液用 Culture Medium： Neurobasal Medium-A 500ml+B27 10ml+Glutamax 100X 5ml2 .耗材1） EMS盖玻片：膜片钳和激光共聚焦检测试验时才需要使用。2） 各型枪头：10 d、100 pl、1000 pl、5ml3 ）细胞培养皿：4）细胞培养瓶：5）离心管：二、步骤1 .手术器械消毒:直头眼科剪、直头、弯头显微银各1把为一套器械，准备两套并分 别置于50ml烧瓶中，70%酒精浸泡30min。2

6、.动物：出生24小时内的SD大鼠（下称乳鼠）约10只；3 .海马组织分离：培养皿2个，分别加入冰冻DHank，液约5ml，至于冰盘上； 取乳鼠，用左手拇指和食指固定乳鼠头部，酒精棉球皮肤消毒3遍，直头眼科 剪 酒精灯火焰消毒后（下同）剪开皮肤，换第二把直头眼科剪剪开颅骨,弯头显微镜向 两侧牵拉开颅骨暴露乳鼠大脑，换第二把弯头显微镶由颅底部分离乳鼠大 脑，然后 置入冰冻的DHank液中。 用直头显微镣固定乳鼠大脑，将两大脑半球分离后，用弯头显微镶分离脑干后， 以直头显微镣固定并敞开皮质，最后用弯头显微镣由海马游离端仔细分离海马组织， 并剔除血管及脑膜。 将分离好的海马组织至于加有冰冻D-Ha n

7、ks液的青霉素瓶中，用直头眼科剪剪碎组织至约1 mr的小块，加入约5倍组织体积的0.25%胰蛋白酶37C消化10min，加入分离培养基终止消化。机械吹打分散细胞，40叩筛网过滤，制成单细胞悬液，1000rpm室温离心6min, 弃去上清液，加Starting medium，尖嘴吸管吹打分散细胞后，制成4X105个/ml的 单细胞悬液，接种在预先包被有多聚赖氨酸（PLL）的培养板内。在通以95%空气、5%CO2,37C细胞培养箱中培养。接种72h后，加入含10讪 阿糖胞音的Culture Medium作用48h，以抑制胶质细胞的过度增殖。之后每隔两 天 用Culture Medium换液，每次更换的量为原体积的1/2，培养12天后对神经元进行 鉴定并用于实验。换液举例：1月1日培养神经元，于1月4日用含AraC （10AM）的Culture Medium换液，AraC作用48小时后（1月6日）用Culture Medium