琼脂糖凝胶电泳标准操作流程

1、琼脂糖凝胶电泳操作标准流程一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。 本铜人阵学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，此关为能力考核，通关成功 后， 代表具备操作琼脂糖电泳的能力。二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这 种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效 应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场 中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成

2、反比。不同构型的DNA分子的迁移速度不同。如环形DNA分子样品，其中有三种 构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA ）、开 环分子（ocDNA）、和 线形DNA分子（IDNA）。这三种不同构型分子进行电泳时的 迁移速度大小顺序为： cccDNA > IDNA >ocDNA影响核酸分子泳动率的因素主要还是：1、DNA分子大小；2、琼脂糖浓度； 3、DNA构想；4、所用的电压；5、琼脂糖种类；6、电泳缓冲液核酸电泳中常用的染色剂是溟化乙锭（ethidium bromide EB ）。溟化乙锭是一 种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射BE-DNA复合物 时

3、，出现不同的效应。254nm的紫外线照射时，灵敏度最高，但对DNA损伤严重； 360nm紫外线照射时，虽然灵敏度较低，但对DNA损伤小，所以适合对DNA样品 的观察和回收等操作。300nm紫外线照射的灵敏度较高，且对DNA损伤不是很大， 所以也比较适用。三、材料、试剂及器具1、材料不同大小的基因组片段；2、试齐！|Hind III digest DNA Marker （分 子量标准）（TaKaRa） ； D2000 （TianGen）；BIOWESTAGAROSE (西班牙琼脂糖)；加样缓冲液(6x):浪酚黄；电泳缓冲液(1XTAE);澳化乙锭(EB);3、仪器及器具(1 )移液器、吸头、锥形

4、瓶(2)电泳系统：电泳仪、水平电泳槽、托盘、胶托、梳子等。(3)紫外透射仪、微波炉、电子天平四、操作步骤1 ,器具清洗：首先将配胶、电泳、染胶所需要的器具清洗干净，包括托盘、胶 托、梳子、电泳槽、染胶盘(EB污染，需独立清洗)。清洗流程为：先用自来水冲 洗三次，然后用纯水冲洗三次，最后用纸巾或医用纱布擦干。若需对电泳产物进 行 胶回收，则还需用75%酒精对器具进行消毒。2,配胶：根据基因组片段大小，配置相应浓度的琼脂糖凝胶。首先将锥形瓶洗干净并 加入少量纯水煮沸，然后量取一定量的电泳缓冲液(1XTAE)至锥形瓶中，再称取 相应量的BIOWESTAGAROSE (西班牙琼脂糖)倒入锥形瓶中，摇匀

5、并用锡纸封 ，最后放入微波炉煮，煮胶的过程中需注意安全，应适当摇匀，防止爆沸。煮好的 凝胶需无气泡、色泽均匀。将煮好的凝胶放入65C的水浴锅中，待凝胶冷却至65C时，及时将凝胶倒入装好的 干净模具中。待凝胶完全凝固后，将凝胶小心转移至4c冰箱，冷冻30min,然后拔梳子。此时， 凝胶需平整、不漏孔，可以用于电泳检测。3 .电泳准备：先将干净的电泳槽排放整齐并做好标记，然后把凝胶连同胶托一起 放入电泳槽正中央，胶孔的方向朝向负极(注意：放凝胶前，需将胶托底部的凝 胶抹干净，防止胶托在电泳槽中滑动；此时，可顺便观察凝胶是否漏孔)，再往电泳槽中倒入一定量的电泳缓冲液(1XTAE )至刚好将凝胶淹没。

6、(注意保持 桌面卫生，防止缓冲液洒到桌面)4 .验孔：用2ul 6X溟酚黄加入到每一个胶孔中，检测凝胶胶孔是否漏孔。若不漏 孔，则可在凝胶孔底部看到一条黄色条带；若漏孔，则看不到条带。(注意：验孔 完毕之后，需将凝胶固定在电泳槽中央)5 .上样：将样品、6X澳酚黄按3： 1的比例混匀，轻甩后按照规定的顺序上样， 上样顺序应与电泳槽上的标记一致，最后点上一定量的Ladder。（注意：上样时 必须确保上样顺序正确无误，样品间不混淆，点样后的空管子先放在电泳槽旁边，用 于核查；点样时不戳孔、不外漏、不溢出；点样时需小心枪头不要碰到凝胶，以 免凝胶挪动，若凝胶已经挪动，需等样品完全沉到底部后，再固定凝

7、胶）6 .电泳：确认已经正确上样后，双手盖上电泳槽盖，接通电泳仪和电泳槽（注 意：确认电极正确连接），设置电泳参数：电压：120V，电流：400mA，时间： 30min ；注意确认电极、电泳参数完全正确之后，最后按star键开始电泳。7 .染胶：电泳结束之后，带上PE手套，小心滑出凝胶，把凝胶转移到干净的PE手 套上（注意：PE手套上应做好标记，确保样品、电泳槽、PE手套的标记是一 致），小心地将凝胶放入相应标记的EB染胶盘中，盖上盖子染30min。其中，染胶 盘放在EB暗房中，EB染液的配方为：100mHXTAE + 5ul EB燃料。（注意： 配制EB染液和染胶时需戴上乳胶手套、PE手套，必要时可戴上口罩，染胶时动作要轻，防止溅起EB染液；注意区分EB污染区与非污染区，防止EB污 染区向非污染区扩散）8 .凝胶成像：带上PE手套，将凝胶从染胶盘中捞出，放在染胶时的那个PE手套 上 （注意：捞胶时需小心防止凝胶断裂、滑落，尽量把多余的EB染液甩干），将凝胶放入凝胶成像系统中，按照“ Tanon凝胶成像系统操作规程”进行操作拍照。 （注意：拍照时需严格区分EB污染区与非污染区，防止EB污染区污染电脑、键盘及鼠标），最后保存胶图信息至规定的文件夹内，命名规则为：日期+