ELISA酶联免疫吸附试验报告

1、大学实验报告幅联免疫吸附试验学院:专业:姓名:学号:一.实验原理酶联免疫吸附试验ELISA是一种用酶标记抗原或抗体的方法,此法是将 抗原、抗体免疫反响的特异性和酶的高效催化作用原理有机地结合起来的技术, 可敏感地检测体液中微量的特异性抗原或抗体.根本原理如下：先使用抗原或 抗体结合到某种固相载体外表,并保持其免疫活性；使抗原或抗体与某种酶联 结成酶标抗原或酶标抗体,这种酶标抗原或酶标抗体即保存了其免疫活性,又保留了酶活性；试验时,把受检标本抗体或抗原和酶标抗原或酶标抗体按不 同的步骤与固相载体外表的抗原或抗体起反响, 用洗涤法去除固相载体上的游离 物质,最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物

2、质的多少有关.当参加酶反应的底物后,底物被酶催化而产生有色物质.颜色反响深浅与受检抗原或抗体的 量成正比.因此,可借助颜色反响的深浅来定性、定量抗体或抗原.本技术的特 点是敏感性高,特异性强,操作简易,结果容易观察.1,包被抗原2洗海 &加待检抗体4 一洗潦5加酶标抗体 氏洗潦7.加底物显色8,观察结果图1 ELISA实验原理示意图二.实验材料BSAK原、兔抗 BSAK体一抗,分别用 PBSffi释成 1:2, 1:4, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256 七个浓度、酶标羊抗兔IgG 二抗、0.05M PH9.6碳酸盐包被缓 冲液、洗涤液PBS、底物溶液、2m

3、ol/L H2SO.三.实验方法1 .包被板的处理：加BSA包被缓冲液稀释为10g/ml至酶标板中,每孔100 仙l ,置湿盒中4c过夜.第二天取出,用 PBSa涤3-4次.2 .取包被好的酶标板,在第一孔中参加 100n PBS作阴性对照,在第2-8孔加 入上述稀释的一抗各100仙l ,置37c保温1h.3 .倾去液体,用PBS®fc涤3-4次后参加二抗各100仙l ,置37c保温30min.4 .倾去液体,用PBS®fc涤3-4次后参加底物溶液各100口,在暗处37c避光显 色20min,最后参加50仙l、2M HSO终止反响.5 .在波长490nm处,测定各孔的光密度

4、吸收值.结果判定：可于白色背景上,直接用肉眼观察结果：反响孔内颜色越深,阳性程 度越强,阴性反响为无色或极浅,依据所呈颜色的深浅,以“+、“-号表示.也可测O-D值：在检测仪上,于490nm处,以空白对照孔调零后测各孔 ODfi, 假设大于规定的阴性对照ODfi的2.1倍,即为阳性.四.实验结果表1酶联免疫吸附OD值检测表加样孔组别1 阴性对照2345678Max与阴性对照OD值之比A0.4160.3860.3540.4050.4440.3900.7390.5311.78B0.5150.4090.4290.4710.4290.3880.2940.4400.91C0.6570.5670.4960

5、.8920.5080.3340.2780.2551.36D0.3730.3710.7790.3500.5140.5020.7800.4062.09E0.3670.4320.6040.6660.4410.4550.4410.3951.81目测各孔颜色较浅；检测其ODfi结果如上表所示,各孔 OD®与阴性对照之比都 小于2.1 ,全部为阴性.五思考讨论1.本次实验结果全部为阴性,可能原因有：(1)抗体制备不成功；(2)洗涤时可能有局部抗体被洗脱下来；(3)样品加样量不准确(实验时局部孔是批量加的样且滴加太快,很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象,不能保证精确性和均一性)；2.其它考前须

6、知：(1)样品和试剂从冰箱取出后,应在室温下(1825c)平衡1h.(2)在操作过程中,加样不可太快,要防止加在孔壁上部,不可溅出和产生气泡.加样太快,无法保证微量加样的准确性和均一性.加在孔壁上部的非包被区, 易导致非特异吸附.溅出会对邻近孔产生污染.出现气泡那么反响液界面有差异.(3)洗涤时,请勿用带纸屑的吸水材料拍板,以防外源性过氧化物酶类或氧化还原物质与显色液发生反响,影响检测结果的准确性.(4)包被时间不少于18h,包被板一经洗涤,那么不宜存放过长时间.(5)包被和温育均应将固相载体放置湿盒内进行.3. BSA免疫血清的制备：可溶性抗原免疫原性弱,一般要加佐剂,常用佐剂： 福氏完全佐

7、剂,福氏不完全佐剂.要求抗原和佐剂等体积混合在一起,研磨成油 包水的乳糜状,放一滴在水面上不易马上扩散呈小滴状说明已到达油包水的状 态.商品化福氏完全佐剂在使用前须振摇,使沉淀的分枝杆菌充分混匀.初次免疫加福氏完全佐剂皮下多点注射I(一般 2.0ml 0.5ml/ 点)J 1周后第二次免疫剂量同上,加福氏不完全佐剂皮下或ipI (ip (腹腔内注射剂量不宜超过0.5ml/只)J 1周后第三次免疫 剂量1.0ml ,不加佐剂,ipI (4天后采血测其效价,检测免疫效果,如果效价不理想可 米取增强免疫)第四次免疫(非必需步骤)J 1周后增强免疫,方法：从耳静脉注射抗原0.1 0.2mL, 一周后放

8、血.ELISA常见方法1间接法 将抗原吸附又称包被于固相载体,孵育后洗去未吸附的抗原,随后参加含有特异性抗体的被检血清, 感作后洗除未起 反响的物质,参加酶标记的同种球蛋白如被检血清是鸡血清,就需用抗鸡球蛋 白,作用后再洗涤,参加酶底物.底物被分解后出现颜色反响,用酶标仪测定 其吸光值OD.2双抗夹心法 用于检测抗原.将特异性免疫球蛋白吸附于固相载体外表,再参加被检抗原溶液,使抗原和抗体在固相外表形成复合物. 洗除多余的抗原,再参加酶标记的特异性抗体,感作后冲洗,参加酶底物,颜色 变化与待测样品中的抗原量成正比.3竞争法 用酶标记抗原和未标记抗原共同竞争有限量的抗体的原理, 测定样品中的抗原.

9、同时应用只加酶标记抗原 的系统作为对照.将抗体吸附于固相载体外表,感作后冲洗,参加待检抗原和酶 标记抗原.对照只加酶标记抗原.感作后冲洗,参加酶的底物溶液,含酶标抗原 的对照应出现颜色反响.而待检系统中,由于样品中未标记抗原的竞争作用, 相 应抑制了颜色反响.当待检抗原含量高时,其对抗体的竞争水平强,形成的不带 酶的抗原-抗体复合物量亦多,带酶复合物的形成量相对减少,产生的有色产物 量也少；反之,待检抗原含量低时,不带酶的复合物少,带酶的复合物量相对增 多,最后有色产物的量增多.除上述方法外,近年来还开展了许多改进方法,如阻断ELISA、LISA、抗体捕捉ELISA等,实际检测中可选择应用.常

10、用方法具体操作步骤见下表：表2 ELISA常见方法操作步骤方法步骤间接法测抗体双抗体夹心法测抗原竞争法测抗原抑制性测定法1包被抗原：用包被缓 冲液稀释抗原至最适浓度520 g g/ml各 0.3ml 加于微反响板每个 凹孔中,4C过夜或37 c水浴23小时, 贮存冰箱包被抗体：用包被缓 冲液稀释特异性抗 体球蛋白至最适浓 度1 10g /ml, 每凹孔加0.3ml ,4 c 过夜,或37 C水浴3小时,贮存冰箱包被特异性抗体：同左包被抗原：同左2洗涤：移去包被液, 凹孔用洗涤缓冲液含0.05%吐温同左同左同左-20洗3次,每次5 分钟3加被检标本：每凹孔 参加用含有0.05% 吐温-20的稀释

11、缓冲 液稀释的被检血清各 0.2ml , 37 C,作 用12小时每凹孔参加0.2ml用 稀释缓冲液稀释的 含抗原的被检标本,37 c作用12小 时.分2组,a组加酶标记 抗原和被检抗原混合?仅0.2ml ,另一组 只加酶标记抗原液0.2ml , 37 c作用 1 2小时.混合液可 作成/、同稀释度.a组加参考抗体和被 检抗原混合液0.2ml ,另一组加参 考抗体与等量稀释剂0.2ml , 37c作用12小时.4洗涤：重复2同左洗涤：同左洗涤5参加酶结合物：每凹孔参加稀释缓冲液稀释的酶结合物0.2ml 37 C作用12小时参加0.2ml用稀释缓 冲液稀释的酶标记 特异性抗体溶液,37 c作用12小时 或由预试头验确7E作用时间.各参加0.2ml抗参考 抗体的酶结合物37 c作用12小时方法步骤间接法测抗体双抗体夹心法测抗原竞争法测抗原抑制性测定法6洗涤：重复2同左洗涤7参加0.2ml底物溶液 于每个凹孔,O.P.D 或O.T,室温作用 30分钟另作一空 白对照,0.4ml底物 加0.1ml终止剂.同左同左