Southern_blot试验方法与步骤

1、实验名称： Southern blot一、实验目的1.学习核酸杂交的根本过程和操作.二、实验原理将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后,通过琼脂糖凝胶电泳进行分 离,继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上, 固定后再与同位素或其它标记物标记的 DNAl£ RNAS针进行反响.如果待检物中 含有与探针互补的序列,那么二者通过碱基互补的原理进行结合,游离探针洗涤 后用自显影或其它适宜的技术进行检测,从而显示出待检的片段及其相对大小. 用途：检测样品中的DNAS其含量,了解基因的状态,如是否有点突变、扩增重 排等.三、试剂与仪器一器材：糖瓷盘,台式离心机,恒温水浴

2、锅,电泳仪,水平电泳槽,杂交炉,杂交袋, 尼龙膜或硝酸纤维素膜,转印迹装置,滤纸,吸水纸,紫外交联仪,摇床, X线 胶片.二试剂：限制性内切酶,DNA&口样缓冲液,DNA Ladder Marker, HCl变性液NaOH NaCl中和液Tris- HCl , 3M NaCD ,转印迹液SSC 3M NaCl,柠檬酸钠,标记探针,20 x SSC预杂交液和杂交液,2X 洗液2XSSC,%SDS2X 洗液 X SSC,%SDS1X缓冲洗液马来酸NaCl ,%Tween201 X封阻液1 %W/V封阻剂J溶于1 X马来酸溶液马来酸,NaCl ,2 x 检测液Tris- HCl, NaCl,

3、 抗-地高辛-碱性磷酸酶.四、实验步骤3 、制备 DNAO PCR4 .琼脂糖凝胶电泳别离DNA3电泳结束后,将胶小心从电泳槽中取出,用手术刀将胶中没有DNA羊品的四周局部略做修剪,然后将胶放入 N HCl中脱喋吟,当胶中的澳酚蓝变 为黄色取出4将胶从HCl溶液中取出,用ddH2O®|洗两次,然后放入碱变性液0.5 M NaOH中处理45 min ,使胶中的ds-DNA变为SS-DNA5取一个瓷盘,注10XSSC横跨窄边架上一块玻璃板,在玻璃板上铺2层30cmx 10cm滤纸,纸条长两侧垂入10XSSC6将胶底朝上放在滤纸上7裁与胶同样大小的尼龙膜平铺到胶上8用塑料布盖住尼龙膜四周,

4、裁与尼龙膜同样大小的滤纸一张,铺在尼龙膜 上.9叠5至8cm高的吸水纸,再压一重物,放置过夜10转印结束后,将尼龙膜切角做记号,放到一张滤纸上,紫外交联 30s11预杂交：将尼龙膜放入到杂交管中,倒入预杂交液,在杂交炉上 42C, 低速转动1h.12杂交：弃预杂交液,往管中导入杂交管液,42 C, 6-20 h.13回收杂交液冻存,往管中参加 50ml 2 x SSC/01%SD觥5min重复一次.14往杂交管中参加 66c预热的50 mL x SSC/%SD S66c洗涤30 min,重 复一次.15 齐洗液,参加 washing buffer 马来酸 buffer/ %Tween20 浸泡 5 min.16 参加 100 mL blocking buffer 封闭液,室温,1 h17倒掉杂交管中的blocking buffer ,参加抗体溶液,25 C ,温育1 h.18 力口入 500ml washing buffer ,洗 2h19将尼龙膜从杂交管中取出,放入盛有 detection buffer ()的大培养皿 中,浸泡5 min.20将尼龙膜铺到一张大保鲜膜上,均匀滴加800 l L CSPD§液,将另一侧的尼龙膜平整地覆盖到膜上,轻轻挤走气泡.37C,温育10 min.21将尼龙膜铺到暗匣中,在暗