基因工程试验设计

1、基因工程实验设计作者:日期:基因工程实验设计DNA重组分子的构建及筛选检测实验原理：Bt蛋白中的Bt是苏云金芽泡杆菌Bac订lus thuringi ensis z/ 的缩写.毒蛋白是其产生的一种伴胞晶体,有时也称为de lta 一endotoxin,即学术刊物中中文所对应delta内毒素.毒是指其对 特定的物种有毒性,并非对所有的生物体都有毒性.而且不 同的Bt菌 系产生的毒蛋白的特异性也不同.Cryl4-4是从苏云金芽 泡杆菌中获得 的一中新的杀虫晶体蛋口样基因,对棉铃幼虫有较强的杀虫活性.实验步骤二目的基因的获得1 ?在NCBI网站上查找目的基因的核心序列1 atgtatatgg ctg

2、aaattaa acgcttagat taCtatttag gtgccttgcc ttttggtaat61 ttttatgtag atgattgtga tactttaaaa aattttatag atagcctttt agatggtaaaccttctacaa tgaataatac actatcttag atgatttaga tatttttcta acgatacaagtcaaagtgtt atatgataat tgagaaagattcctctaaca ggtaatgtaa atgttacaaa ttccatagca accctaaccc cagaatatgt tactgaaaaa acttatc

3、aaa ccttatctttgtacaaacaa cagttagtac gctgaagCaa aaggaagtgt gcagaaattt ctggacaata caaaaattaa ttattccttccaaattatgt tagcaaaaataactgttacc catggattcc aaattggagg aagtattcct ttcgttgcag atggcggggt taatttttct tcagcagata cagaaacaac tcagtccggt aacattcgac ctggttatac taatattcca caaacagcag ttcatttttcgaaacttgga tac

4、tgtaagt aacaacttctaacaagggtt tggttctatgtcaggaacag tacatcggga ttatatgatg aagtaaggtc acaggtttag tattaaataa actggttcaa ttactgcatt tcttcccaag aaaatataagtccaatccct agtagtgtaa taggcttggttctagaaaat aattgt;tca attcaacagtcgctaatcaa agtgtagatt ttacaggaagtaatttttat gtaaaaatta ctgaatatccatggtactca atagaaccaa aa

5、gtattaaaagactacgat aggtagagat tggatttttt aattaataattcaatcaattatacgacatc gttttccttcaaattcttct gtgaatactt gtaattgcta2?根据所查序列运用primer 5.0进行引物设计3?确定适合引物的序列及位置,设计酶切位点及加保护碱基上游弓 I 物：5CCCCGGGATGTATATGGCTGAAA3 ,Smal下游弓 I 物：5CGAGCTCTTAGCAATTACAAGTACC3 ,Sacl所选限制性内切酶酶切序列及酶切点：Smal:CCOGGGSacl:GAGCPC4.菌体培养：将获得的苏云金

6、芽泡杆菌于 YT液体培养基,丁 30C振 荡培养过夜,获得足够的菌体.收集菌体注意吸干多余的水分.辅助裂解：如果是T菌,应先加溶菌酶100ng/mL 50uLo 37 C处理 lho运用CTAB法提取DXAo将提取的DNA用PCR扩增获得目的片段.二.构建克隆载体质粒pEASY ? T 1质粒1 ?连接T载体,转化大肠杆菌,涂平板 LB固体培养基加Kan和Amp , 37 C培养12-16小时后,菌检M13引物.附图：质粒pEASY-T 1图谱原理：很多DNA聚合酶在进行PCR扩增时会在PCR产物双链D NA 每条链的3,端加上一个突出的碱基 A.pEASY-Tl载体是一种己 经线性 化的载体

7、,载体每条链的3,端带有一个突出的To这样,pE ASY-T1载 体的两端就可以和PCR产物的两端进行正确的AT配对,在连接酶的 催化下,就可以把PCR产物连接到pEASY-Tl载体中,形成含有目的 片断的重组载体.反响体系：T载体,T4 DNA连接酶,连接酶缓冲液10 x buffer, 无菌 dd Water2?从菌检正确的菌落上挑菌摇菌LB液体培养基加Kan和Amp 12? 16h后,提取质粒,送去检测.三.表达载体的构建pBI121质粒附图：pBI121质粒图谱(14,662) NOtl(12,671)1,02Sfil(10.709) PfIMI*-(10,475) Ndel(9695

8、)BstEII(KllO) PasIEcoNI (1627)PBW1 1 14,758 bp(2492)I (2700 (2715 Bmtl (2719)BamHI (5821) TspMI ? Xmal (5 Smal (5828)BspDI ? Clal (4537)lindni (4950) (4966) Bsalw PspOMI (S899) Apal (3903)SanDI (9007)(8953) AhdlSbflSealXbal(5815)SnaBI (6229(8290) Drain(7982) EcoRl(7715) SacI Eco53kl (7713)酶切体系：30CTango? buffer IXSmalSacl1 ?将目的片段确定正确的T质粒酶切,跑胶,切胶回收,获得带酶切 位点的的目的片段,目的载体 PBI121也进行酶切,跑胶,切胶回收.2 ?将酶切片段和酶切后的载体连接.四.目的基因的检测与筛选1 ?将表达载体运用CaCb法转化大肠杆菌,涂平板 LB固体培养基加 Kan , 12-16h后,菌落PCR 所设计的引物.2?从菌检正确的菌落上挑菌摇菌 LB液体培养基加Kan和Amp 12? 16h后,提取质粒.进行酶切验证.将酶切验证结果正确的菌落的 质粒转化农杆菌,涂平板 YEB固体培养基+Kan+Rif ,长出菌落 后, 菌检所设计的引物,将菌