CarT细胞培养标准操作流程

1、1/ 3Car-T细胞培养标准操作流程1目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。2范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养3责任人：实验员人、临床相关人员。4内容4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2t养瓶，150 cm2t养瓶，EPt,1.8ml冻存管4.2试剂：X-VIVO 15TM PBS缓冲液，75淞用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。4.3环境：4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在百 级生物安全柜内进行。4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒， 紫

2、外线照射时间 不少于30min,消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min,生物安全柜运行稳 定后方可操作。4.4操作：4.4.1采集接收外周血4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。4.4.1.2接收外周血并填写外周血采集交接记录 ，核对外周血患者相关信息， 及相应检测报告， 报告由医院提供， 至少包括：HBsAg，HCVA，bHIVAb，Anti-TP，ALT。4.4.2操作前准备4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30mi n,生物安全柜运行稳定。4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。4.4.2.3生物安全

3、柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。4.4.3分离单个核细胞（PBMC）：4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋 内外周血转入50ml离心管中。2/ 3443.2用PBS 缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。443.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方 法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落 铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。4.4.3.4配平离心1200g(2100r/min)离心20min,慢升慢降。4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至

4、上： 红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mr左右处弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细胞悬液体积比应大于1:3，混匀。4.4.3.6离心600g(1600r/min)5min,PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。4.4.3.7离心300g(1200r/min)5min,上清液送检无菌检测。4.4.4细胞培养：4.4.4.1细胞培养条件：恒温37C,CO浓度5%,相对饱和湿度95%细胞培养基PH值7.2-7.4。4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中(T150 200 x106/100ml, T751

5、00 x106/50ml ,T25 50 x106/25ml)。混匀放入CO培养箱培养2小时。4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起， 培养瓶倾斜30度角， 移液管吸取培养基转入离心管中， 少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集， 混 匀计数。4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中(100-120ml in a T150,50-60ml in a T75,15-29ml in a T25)， 力卩CD3/CD2磁珠， 按细胞与磁 珠比例为1:3(加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液)，加入IL-2 100U/ml, 混匀放入CO培养箱培养。4

6、.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒(MO为1-5) 混匀放入CO培养箱培养。4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml 继续培养。4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中， 在磁力架上去除磁珠， 细胞计数补加培养基，IL-2100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细 胞碎片及杂3/ 3质情况，每2-3天加液培养。4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要， 培养9天时细胞数量达到要求， 各项检

7、测 合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。4.4.5 Car-T细胞收集：4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应 细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。445.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。445.4除去上清培养液，加PBSg冲液稀释混匀，300g离心5min,弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100卩m细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进 行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5冰射用人血白蛋白，贴上标签，并填 写相关记录。4.5细胞运输与保存：4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。4.5.2细胞盐水袋放置于运输