LNT对视神经损伤后RGC保护作用的实验研究.

1、LNT 对视神经损伤后 RGC 呆护作用的实验研究 论文导读：随机分成 5 组，一组（ 6 只 12 眼）为正常对照组，另 4 组 （各 12 只 12 眼）为实验损伤组，其中左眼为损伤对照组（即视神经钳夹玻 璃体腔内注射 0.1ml 生理盐水组），右眼为损伤治疗组（即视神经钳夹玻璃 体腔内注射100ug/0.1ml 香菇多糖组）。TUNE 检测试剂盒、超氧化物歧化酶 （SOD 测试盒，均购自南京建成生物研究所。 关键词：视神经损伤，香菇多 糖，视网膜神经节细胞，超氧化物歧化酶 视神经由视网膜神经节细胞（RGC 的轴突组成，为中枢神经系统 的一部分，损伤后由于缺乏神经修复和再生所需的微环境和物

2、质，因此视神经 损伤后的治疗和功能恢复是临床上的一个难题 1 。几十年来，视神经损伤的治 疗多采用药物治疗和手术治疗两种方法。药物疗法多是采用神经营养因子、兴 奋性氨基酸拮抗剂、神经节苷脂、钙通道阻滞剂、氧自由基清除剂、糖皮质类 固醇等，对改善血管源性组织水肿，抑制过氧化脂质的形成，提高视神经损伤 的组织修复能力，对恢复视神经功能起到一定的作用，但效果仍不理想，且多 处于动物实验阶段。因此，寻找一种具有综合疗效且毒副作用小的神经呆护剂 是近两年众多学者研究的方向。许多人把目标转向了神经免疫疗法，并不断将 免疫增强剂投入实验研究，已取得了一定成果。早在 1998 年我国就有将生物多 糖注射入大鼠

3、玻璃体内治疗视神经损伤的实验记载 2。香菇多糖（LNT 是 1969 年被首次发现。LNT 进入机体后能快速通过血脑屏障及血眼屏障发挥作 用， 是目前国内外都广泛应用的抗肿瘤药物。 实验证实香菇多糖有清除氧自由 基、调节一氧化氮（NO）及抗脂质过氧化、提高 SOD 舌性的作用3,4。本研究旨 在通过Tunel 及生化法检测 RGC 勺凋亡及 SOD 舌性变化情况，探讨 LNT 影响 RGC 勺的影响进行了初步研究。 1.1 实验动物及分组 纯种大耳白兔 54 只，体重 3.0 0.2kg，雄性，外眼及眼底检查均正常。随机分成 5 组，一组 （6只 12 眼）为正常对照组，另 4 组（各 12

4、只 12 眼）为实验损伤组，其中左 眼为损伤对照组（即视神经钳夹玻璃体腔内注射 0.1ml 生理盐水组），右眼 为损伤治疗组（即视神经钳夹玻璃体腔内注射 100ug/0.1ml 香菇多糖组）。 各组分别于伤后 1d、3d、7d 和 14d 取材。 1.2 主要试剂及材料 香菇 多糖，购自南京康海药业股份公司。论文参考网。 TUNE 检测试剂盒、超氧化 物歧化酶（SOD 测试盒，均购自南京建成生物研究所。论文参考网。 1.3 模型制备 正常对照组不做任何处理。实验组均用 10%的水合氯醛 （ 3mg/kg 耳缘静脉注射麻醉，于兔眼眶上皮肤切口逐层分离暴露视神经。游 离视神经约 3mm 离后极部约

5、 3mn 处用同一大号无创血管钳于同一部位钳夹视 神经 15s。术后兔眼对光反射迟钝，眼球无明显突出，眼压正常，眼睑闭合完 全者为成功模型。伤后充分散瞳，用无菌结核菌素皮试注射器抽取 1mg1ml 的 香菇多糖 0.1ml（100ug 给实验损伤组兔右眼做玻璃体内注射，实验损伤组兔 左眼同样方法注入 0.1ml 生理盐水，术后处理同右眼。 1.4 取材及固定 实验损伤组的兔各组随机抽取四只分别于致伤后 1d，3d，7d 和 14d 用以下方法 取材固定： 10%的水和氯醛耳缘静脉注射麻醉。切开胸腔暴露心脏，将生理盐水 冲洗液用输液器针头穿刺入左心室至升主动脉，剪开右心耳放血，至右心耳流 出清亮

6、液体为止，换成 PH 值为 7.2 的 4%多聚甲醛固定液，再灌注固定 15- 20 分钟。摘除眼球并保留视神经长约 5mm 做角膜穿通口，置于上述固定液中固 定，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片厚约 2.5 卩 m 备用。其它动物采取空气 栓塞法处死后，取出眼球，至于冰生理盐水中，剪开角巩膜缘，弃去眼前节及 玻璃体，外翻眼球壁，在显微镜下剥离视网膜，分析天平称重，用生理盐水稀 释，匀浆，低温离心机 3000r/min 离心 10 分钟，取上清液，黄嘌呤氧化酶法测 定 SOD 舌性。 1.5 检测指标 光镜下观察视网膜形态及视网膜节细胞 数量的变化；行 Tunel 染色观察凋亡细胞的定位并计数；

7、行黄嘌呤氧化酶法测 定 SOD舌性。 1.6 统计方法 数据用 SPSS13.0 软件包，取为 P=0.05 检 测标准采用单因素方差分析法进行统计分析。 2 结果 2.1RGC 形态及 数量改变 视网膜切片中显示凋亡细胞不仅见于视网膜神经节细胞层，还见 于内外核层。凋亡细胞胞核染色呈棕黄色，部分可由于核固缩扭曲破裂而失去 正常形态，并可见凋亡小体。正常对照组视网膜切片偶见极少量的凋亡细胞 0.31 /mm2 本实验仅计数节细胞层的凋亡情况进行比较研究。损伤对照组：于 伤后 1d、3d、7d 和 14d 的凋亡细胞数分别为 1.58 /mm2 14.21 /mm2 25. 61 /mm2 12

8、.09/mm2 损伤治疗组：于伤后各时间点的凋亡细胞数分别为 1.10 /mm2 9.95 /mm2 18.33/mm2 10.20/mm2 除 1d 组外，同一时间点损伤对 照组和损伤治疗组比较，差异具有统计学意义（P0.05）。说明此种治疗方法 能够减少视神经损伤后 RGC 勺凋亡。 2.2 视网膜内 SOD 舌性：正常视网膜 组织匀浆中 SOD 舌性为 214.68 卩 U/mgprot。损伤对照组 SOD 舌性：各时间点分 别为 154.68 卩 U/mgprot、299.11 卩 U/mgprot、238.56 卩 U/mgprot、 217.56 卩 U/mgprot。损伤治疗组

9、SOD 舌性：各时间点分别为 254.87 卩 U/mgprot、333.77 卩 U/mgprot、291.07 卩 U/mgprot、 232.44 卩 U/mgprot。除伤后 14d 组外，同一时间点损伤对照组和损伤治疗组比 较，差异有统计学意义（P0.05）。表明香菇多糖能明显降低脂质过氧化物的 产生，提高超氧化物歧化酶的舌性，从而降低视网膜受氧自由基损伤的程度。 3 讨论 视神经夹伤后对轴突产生直接的机械压迫效应造成部分轴突损伤， 通过应激反应刺激 RGC 发生急剧的生化反应而迅速溃变坏死。部分受损的 RGC 释放的细胞毒素、氧自由基，或局部的钙离子超载等作用，导致 RGC 发生以

10、凋 亡为主的继发性改变，使得 RGCS 一步丢失并丧失视功能。本实验观察到损伤 实验组于伤后 1d 即出现凋亡细胞，伤后 3d 时凋亡细胞显著增多，伤后 7d 时凋 亡细胞达高峰，14d 凋亡率下降。文献报道5及本实验凋亡细胞计数结果表 明，视神经损伤后凋亡程序一旦被启动，凋亡细胞的数量将逐渐增加，达到一 个高峰，然后再逐渐减少直至停止凋亡，这种变化规律与治疗与否无关。但是 视神经损伤后早期恰当的治疗能够使细胞凋亡程度减弱， 凋亡细胞数量的峰值 降低， 使残存的节细胞数量增加，从而有利于保护伤后视功能。本实验损伤治 疗组于伤后早期（1 小时内）给予 LNT 玻璃体腔内注射，结果显示各时间点凋

11、亡细胞数量较损伤对照组明显减少，较正常对照组又明显增多，也进一步验证 了上述细胞凋亡的规律。论文参考网。因此，视神经损伤的治疗应在细胞凋亡 程序启动之前进行，才能及时挽救濒死的视神经和保护未受损的神经。本实验 通过早期单次玻璃体腔内给药能够减少视网膜节细胞的凋亡，为进一步的治疗 争取到宝贵的时间。 近年来，LNT 除了作为抗肿瘤药物在临床上被广 泛应用， 目前， 在糖尿病等易造成机体组织缺氧的疾病研究中的疗效也日益凸 现出来。侯敢等研究证实 LNT 具有清除氧自由基和调节 NO 及抗脂质过氧化的作 用6。陈三妹等7实验探讨了 LNT 对糖尿病巨噬细胞脂质过氧化作用及一氧 化氮（NO）水平的影响

12、，结果发现 LNT 可使糖尿病大鼠巨噬细胞内的 NO 含量及超 氧化物歧化酶（SOD）舌性升高，在防治糖尿病继发感染中有重要意义。此外， LNT 对糖尿病大鼠的心肌亦有保护作用8。吴步猛等9实验还发现，使用了 LNT 的糖尿病大鼠，脑组织病变明显减轻， SOD 舌性明显升高，NO MDA 含量明 显下降。因此说 LNT 还具有脑保护作用。LNT 作为一种扶正祛邪中药具有明显 的抗氧化剂保护神经细胞的作用。本实验证实玻璃体腔内注射 LNT 后，与损伤 对照组相比较，治疗组视网膜的 SOD 舌性明显升高而且治疗组凋亡的节细胞数 显著低于损伤组，因此 LNT 能通过其抗氧化作用提高视网膜节细胞存活率

13、，有 效保护视功能。 参考文献 1 芮菁.香菇多糖的药理作用和临床应用概况 J. 天津医药 , 2000, 12(1): 35-37. 2 Rapalino O, Lazarov-SpieglerO, Agranov C, et al. Implantation of stimulated homologous macrophages resultsin partial recovery of paraplegic ratsJ. Nat Med, 1998, 4:814-821. 3 郭丽花,姜 德咏,邝国平,万华.巨噬细胞条件培养基对人视网膜色素上皮细胞舌性和增值的 影响J.武警医学，200

14、4,15(9):664-667. 4 Sicard RE. Differential inflammatory andimmunological responses in tissue regeneration and repairM. Ann NY. Acad Sci,2002,961:368-371. 5 朱豫, 盛艳娟, 黄波. 大剂 量甲基泼尼松龙对大鼠视神经挤压伤后 RGC 凋亡的影响J. ChinOphthal Res, 2003, 21: 582-585. 6 侯敢, 黄迪南 , 祝其峰 . 香菇多糖多巨噬细胞一氧化氮和 酶舌性和还原性谷胱甘肽的影响 J. 中国老年学杂志 ,2002,22(5):396-397. 7 陈三妹 , 李