瘦肉精检测原理及操作步骤

1、瘦肉精检测原理及操作步骤?时间：2011-03-22 来源： 作者：一、测定原理“瘦肉精”克仑特罗竞争酶标免疫检测方法快速测定的基础是抗原抗体反应。酶联板的微孔包被有针对兔抗克仑特罗特异性抗体的羊抗体（第二抗体）。加入兔抗克仑特罗特异性抗体（第一抗体）与第二抗体结合而被固定，洗涤后加入标准液 或样品溶液与酶结合物（酶标记抗原），标准液或样品中的游离抗原与酶标抗原竞 争兔抗克仑特罗特异性抗体上有限的结合位点。通过洗涤除去没有与特异性抗体结合的酶标抗原，加入酶基质（过氧化脲）和发色剂（四甲基联苯胺）并孵育，结合 到板上的酶标记物将无色的发色剂转化为蓝色的底物。加酸终止反应后，颜色由蓝色转变为黄色。

2、在单波长 450 nm处测吸光度，吸收光强度与样品中的克仑特罗浓 度成反比。二、试剂盒的组成每个盒中（包括标准分析孔）材料如下：（1） 1X 96孔板（12排X8孔），包被有第二抗体（兔IgG抗体）；（2） 6个标准液（300ul/瓶）为克仑特罗水溶液。浓度分别为0 ng/kg、100 ng/kg、300ng/kg、900 ng/kg、2700 ng/kg、8100 ng/kg ;（ 3） 1 个克仑特罗过氧物酶标记物浓缩液12 ml （红色帽）；（4） 1个克仑特罗抗体浓缩液 12 ml （黑色帽）；（5） 1个酶基质/发色剂11 ml （蓝色帽）；（6） 1个反应停止液，1 mol/L硫酸

3、14 ml （黄色帽）；（7） 1个缓冲液25 ml，酶标记物及抗体浓缩液稀释用。试验材料1、设备微孔板酶标仪（450 nm）、均质器、冷冻离心机、离心管（50 ml ）、微量可调移液器（单道、八道）、RIDAC18柱、滤纸（0.45卩m）。2、试剂甲醇（分析纯、100%、50 mmol/LHCL、10 mmol/LHCL、50 mmol/L 磷酸二氢 钾缓冲液（pH 3.0 ）、500 mol/L 磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.0 ）、1 mol/LNaOH。四、储存条件试剂盒保存于2-8C，不要冷冻。不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与干燥剂 一起重新密封。标准物质和无色的发色剂对光敏感，避免直

4、接暴露在光线下。五、试剂变质的迹象发色剂有任何颜色表明已变质，应当弃之。0标准的吸光值小于 0.6时，表示试剂可能变质。六、样品处理1、尿样尿样一般不用处理，取 20清亮尿样直接测定。如果尿样混浊要过滤或离心至得到清亮尿样。2、肝脏、肉样粉碎的5g样品与25ml50 mmol/L HCL混合，振荡1.5 h，以达到均质的目的。称6g均质物（相当于1 g肝脏），加入离心管中。10-15C条件下（非常重要）4000 转/min或更高的转速离心15 min。转移上清液到另一个离心管中，加300卩l 1mol/LNaOH昆合15 min。加入4 ml 500 mmol/L 磷酸二氢钾缓冲液（pH 3.

5、0 ），简单混 合并在4C保存至少1.5 h或过夜（非常重要）。10-15C条件下（非常重要）4000 转/min或更高的转速离心15 min。分离全部上清液（应是清亮的，非常重要）， 使其升至室温（20-24C），然后用 RIDAC18柱纯化。RIDAC18柱纯化样品必须在室温条件下（20-24C），并严格控制过柱时流速。用3 ml甲醇洗涤柱子，控制流速为 1滴/s。用2ml洗涤液（50 mmol/L磷酸二氢 钾缓冲液pH 3.0 ），洗涤柱子。肝脏、肉样的全部上清液进柱，控制流速为1滴/4s。用2 ml洗涤液（50 mmol/L磷酸二氢钾缓冲液 pH 3.0 ），洗涤柱子，流速为 1滴/s

6、。用正压除去残留的流体并用空气或氮气吹2 min，干燥柱子。用1 ml甲醇洗脱样品，控制流速1滴/4s。在50-60C并在弱空气或氮气流下完全蒸发甲醇溶齐購用1 ml蒸馏水溶解干燥的残留物，取20卩l进行分析。3、饲料取10g饲料样品，用10 mmol/LHCL溶解，连续震荡10 min，用滤纸过滤，在 滤液中加入120卩l 1mol/L NaOHt行中和，检查pH,用NaOH控制PH值在6.5-7.5 之间，取上清液20卩l进行分析。稀释倍数为 25 （即含有0.04 g饲料样品/ml ）。七、测定步骤第一步：所有试剂及样品在开始检测前必须回升至室温（20-24C），测定操作在20-24C下

7、进行。第二步：用盒中缓冲液以体积1: 10的比例稀释实际用量的克仑特罗抗体浓缩液（黑色盖），稀释前轻轻混均抗体，不要猛烈振荡。第三步：取出实验需要数量的微孔板条，足够标准和样品所用的数量，标准和样品做两个平行试验，记录标准和样品的位置。剩余的微孔板条放进原锡箔袋中并 且与提供的干燥剂一起重新密封，置于2-8C冷藏。第四步：每个微孔中底部加 100卩I稀释后的抗体溶液，室温（20-24C）孵育 微孔板15 min，避免光线照射。第五步：孵育的同时进行酶标记物的稀释，用盒中缓冲液以体积 1 : 10的比例稀释实际用量的克仑特罗酶标记物浓缩液（红色盖），稀释前轻轻混均抗体，不要猛烈振荡，避光放置。第

8、六步：洗板，甩出孔中液体，将微孔架倒置在吸水纸上拍打，直到纸上无明显水迹（拍打3次），以保证完全除去孔中的液体。用250卩I蒸馏水充入孔中，再次甩掉微孔中液体，并在吸水纸上拍打，重复操作两次。加洗涤水的移液器管尖 必须置于微孔上方约 0.5 cm处打出洗涤水，避免将板孔中的游离抗体带入洗涤水 中。洗板后立即进行下一步操作，不要让板孔干燥。第七步：加入20卩I标准或处理好的样品到各自的微孔底部，标准和样品做两个平行实验。第八步：加入100卩I稀释了的酶标记物至微孔底部，轻轻震荡微孔析并在桌面上作圆周运动以混匀。移液器管尖不要接触到孔中的混合物，避免交叉污染。第九步：室温孵育微孔板 30 min，

9、避免放置，尽可能每隔10 min轻轻振荡1次，准备好酶基质/发色剂，并注意避光放置。第十步：洗板，同第六步。在洗板过程中加洗涤水的移液器置于微孔板上方0.5 cm处打出洗涤水，避免将板孔中的游离酶标记物带入洗涤水中。第十一步：不要让板孔干燥， 迅速加入100卩I酶基质/发色剂到每个孔中， 步 骤操作要迅速，避免头尾反应时间相差过长，轻轻振荡板并在桌面上作圆周运动以 混匀。移液器管尖不要接触微孔中的混合物，避免交叉污染。第十二步：室温暗处孵育微孔板15 min，暗处避光放置，同时准备好反应停止液。第十三步：每孔加入100卩I反应停止液，混匀，60 min内用酶标仪测量450 nm 处波长吸光度值。八、结果所获得的标准和样品吸光度值的平均值除以第一个标准（0标准）的吸