兽医药理学教学实践结题报告——纸片扩散法测定大肠杆菌对6种抗生素的敏感性

1、兽医药理学实践教学结题报告纸片扩散法测定大肠杆菌对6种抗生素的敏感性专业班级：指导老师：完成时间：实践地点：大肠杆菌对 6 种抗生素的敏感性检测(四川农业大学动物医学 2009级1 班)摘要： 大肠杆菌病 (Colibacillosis) 是由致病性大肠杆菌引起的消化道传染病，流行广，发病率 和死亡率较高。这种病原菌主要经动物的消化道而感染。能够引起多种畜禽发生急性、慢性 或隐性感染。药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对 病原微生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助 于经验性治疗选药。通过此试验可以帮助我们学习了解细菌对药物的

2、敏感试验的常用方法， 并根据这一原理 ,测定抗菌药物的质量 ,防伪劣假冒产品和过期失效药物。 以防盲目地滥用抗菌 药物, 造成药物的浪费 ,同时也贻误了治疗时机，会给养殖户造成了很大的经济损失。关键词： 大肠杆菌 抗生素 敏感性前言： 致病性大肠杆菌是引起动物感染最常见的病原微生物，它可引起畜禽发生严重腹泻和 败血症等，给养殖业造成了巨大的经济损失。抗菌药物的应用在很大程度上控制了这类病原 菌的发生。但是随着药物的广泛使用，尤其不合理用药，耐药细菌迅速产生，多重耐药现象 日趋严重，严重影响抗菌药物的有效使用，给新药的开发带来巨大压力，同时也带来了动物 源食品的安全性问题，对人类的健康构成了潜在

3、威胁 1,2 。本次实验初步了解了各场大肠杆菌 耐药性的发生和流行现状，为养殖场合理用药提供依据。一、实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼 脂中的水分，溶解后便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌浓 度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。该抑菌圈表示药物对该种细菌的生 长繁殖具有抑制作用。通过测定抑菌圈的直径大小，可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径 越大表示药物抑菌作用越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用弱，没有抑菌圈表示该药物 没有抑菌作用。并且，经稀释法测得的 MIC 的对数和用纸片测定相应的菌株得到的抑菌直

4、径 之间大致呈直线相关，因此将两种方法相对应地测试各种据菌株所得数据，进行统计学的相关回归分析处理，可得到一条回归线，依此可推断该菌株的MIC,两者呈负相关关系，即MIC愈小，抑菌圈直径愈大。二、实验材料1. 药品及细菌诺氟沙星、新霉素、硫酸链霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰乐菌素、生理盐水、磷酸盐缓冲液、MH营养肉汤、MH琼脂培养基、大肠杆菌。2. 器材纸片、试管、移液器、烘箱、培养皿、培养箱、镊子、 1000ml烧杯、PH试纸、量 筒、天平、高压灭菌锅、三角瓶、打孔器。三、实验步骤1. 培养基的制备 ：MH（Mueller-Hinton ）琼脂平板的制备方法：组成：牛肉粉300g水解酪蛋白17

5、.5g可溶性淀粉1.5g蒸馏水加至1000ml，pH调制7.4 ± 0.2，（约每升含Cf500mg Mg+25mg按上述配比称取各试剂于烧杯内加入蒸馏水加热溶解， 调整pH值，使其高压灭菌后的pH 为7.4，加蒸馏水至所需的体积，放于三角瓶内，用棉塞塞好，以 1520磅压力灭菌20min, 后趁热倒入预先灭菌过的培养皿中，平放冷却，即为 MH肉汤培养基。注：有的菌不在其中生长者，可在其中加入 510g葡萄糖或5%（体积分数）羊血或10%（体 积分数）兔血清。MH琼脂平板就是在上述培养基中加入 17g的琼脂粉即可。2. 药敏纸片的制备2.1 纸片制备选择优质新华1号滤纸，用打孔器制成

6、直径6mm勺圆形滤纸片。每200张一管，经120C 2h 灭菌后备用。2.2 药物稀释每张以吸入20卩L药液为标准，如纸片薄，药物原液需作调整。根据纸片内各种抗菌药 物的不同浓度配制药物原液，其浓度需比纸片浓度大200倍，如青霉素G的纸片为10U/片，青霉素G的原液浓度为2000U/mL 200张纸片内即加入1mL青霉素G原液。药液浓度见下表。纸片内抗菌药物含量抗生素纸片浓度U/卩g/片抗生素纸片浓度U/卩g /片抗生素纸片浓度U/卩g /片甲氧苯青霉素5卩g卡那霉素30卩g氯林肯霉素（对阳性困）2卩g氨苄青霉素10卩g链霉素10卩g万古霉素30卩g羧苄青霉素100 卩 g妥布霉素10卩g多粘

7、菌素B300U大环内酯类15卩g庆大霉素10卩g四环素类30卩g杆菌肽10U新生霉素30卩g红霉素15卩g头抱菌素类30卩g新霉素30卩g利福平5卩g2.3纸片浸润、干燥、保存用无菌操作法将待测的抗菌药物溶液1ml （含药量按表所列计算，例如，庆大霉素10卩g/片X 100片=1000卩g /ml ）,加入摊布于灭菌平皿中的100片纸片中，置冰箱内浸泡12小 时，必要时可不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，如立即实验可不烘干，若保存备用可用 下列一种方法烘干（干燥的抗菌素纸片可保存6个月）。A. 培养皿烘干法将浸有抗菌药液的纸片摊平在培养皿中，于 37C温箱内保持23h即可干 燥，或放在无菌室内

8、过夜干燥。B. 真空抽干法 将放有抗菌药物纸片的试管置于干燥器了，用真空抽气机抽干。纸片的保存将制好的各种药物纸片装入无菌小瓶中置冰箱内保存备用。（纸片不应长期 保存于常开的普通冰箱中，也不要放在其他不能维持适宜温度的容器中。）收到纸片后应立即 保存在-204 C中，由于实验室冰箱频繁地开关而不能维持适宜的温度，故常开的冰箱中只能放置1周使用的纸片；纸片容器打开前先置室温平衡（装纸片的容器自冰箱取出后，必须在 室温10min以上才能打开，如立即打开，空气中的水分会冷凝在纸片上，易潮解），纸片贴毕应把未用完的放回冰箱中。3. 细菌的制备从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至35m

9、LMH肉汤培养液中37r培养28h,以待生长至轻微或中等浊度。也可直接从孵育 1824h的琼脂平板上挑去 纯菌落制成肉汤。为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。因此，将菌液 稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约 为 1.5 X 108个/L。F表为麦氏比浊管制法:试管（口径相等）1234567891010g/LBaCI2 (mL0.10.20.30.40.50.60.70.80.91.01%屯硫酸9.99.89.79.69.59.49.39.29.19.0相当细困数（亿/mL）369121518212427304. 接种平

10、板制备好的接种菌液必须在15min内使用。用灭菌好的棉试子蘸取菌液，在管壁上旋转挤 压几次，去掉过多的菌液。然后用试子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋转60°, 最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。5. 粘贴药敏试纸待平板上的水分被琼脂完全吸收后开始贴纸片。用镊子取纸片一张，贴在琼脂平板表面， 用镊子尖轻压，使其贴平，纸片一旦贴上就不能再拿起，因为纸片中的药物已经扩散到琼脂 中。纸片间距离不小于 24mm纸片中心距平皿边缘不小于 15mm直径为90mm勺平板最好贴 6张。贴好纸片后，需在15min内置35°C培养箱内培养。培养时，平板需在培养箱内单独摆 放，否则中

11、间的平板达不到培养箱内的温度而产生预扩散作用，平板培养1824h后，读取结果。四、结果判定培养后取出平板，测量抑菌圈的直径。抑菌圈的边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限。有的菌株可出现蔓延生长进入抑菌圈，磺胺类药的抑菌圈内会出现轻微生长，这些均不作为 抑菌圈边缘。按抑菌圈直径判断细菌的敏感性。抑菌圈直径（mr）i敏感度20mm及以上极敏15 20mm高敏10 14mm中敏10mm以 下低敏0mm不敏五、实验结果大肠杆菌对7种药物的敏感性抑菌药物抑菌圈直径（mr）i敏感度卡那霉素22.56高敏新霉素23.16高敏氟苯尼考25.62高敏多黏菌素9.61低敏诺氟沙星23.58高敏泰乐困素23.63高敏六

12、、结果分析与讨论1. 抗菌药物敏感性试验方法-纸片扩散法药敏试验，是指对敏感性不能预测的分离菌株进行试验，测试抗菌药在体外对病原微 生物有无抑制作用，以指导选择治疗药物和了解区域内常见病原菌耐药性变迁，有助于经验 性治疗选药。抗菌药物敏感性试验方法很多，常见有纸片扩散法，稀释法，E试验。本实验中采用纸片扩散法，操作简便，所需器材简单。通过此试验可以帮助我们学习了解细菌对药 物的敏感试验的常用方法，并根据这一原理，测定抗菌药物的质量，防伪劣假冒产品和过期失 效药物。2. 实验中大肠杆菌的耐药情况大肠杆菌对24种抗菌药物的敏感性如上表所示。从表中可以看出，大肠杆菌对多粘菌 素的敏感性较低外，对诺氟

13、沙星、新霉素、氟苯尼考、卡那霉素、泰乐菌素等 5种抗菌药物 抗菌药物都显示很高的敏感性。由此可见，实验中所采用的大肠杆菌还未产生明显的耐药性。该株大肠杆菌对多粘菌 素的敏感性明显降低，说明其耐药性有上升趋势，应注重平时抗生素的合理使用。3. 实验中抗生素的主要作用诺氟沙星具广谱抗菌作用，尤其对需氧革兰阴性杆菌的抗菌活性高，对肠杆菌科的大部 分细菌在体外具良好抗菌作用，体外对多重耐药菌亦具抗菌活性。诺氟沙星为杀菌剂，通过 作用于细菌DNA螺旋酶的A亚单位，抑制DNA勺合成和复制而导致细菌死亡。新霉素对葡萄球菌、棒状杆菌属有良好作用，对大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属 等肠杆菌科细菌亦有良好作用

14、，对各组链球菌、肺炎链球菌、肠球菌属等活性差，铜绿假单 胞菌、厌氧菌等对本品耐药。链霉素对许多革兰阴性杆菌如大肠埃希菌、克雷伯菌属、变形杆菌属、肠杆菌属、沙门 菌属、志贺菌属、布鲁菌属、巴斯德杆菌属等也具抗菌作用；脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌亦 对该品敏感。链霉素对葡萄球菌属及其他革兰阳性球菌的作用差。各组链球菌、铜绿假单胞 菌和厌氧菌对该品耐药。氟苯尼考对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌及支原体等均有作用。泰乐菌素在临床上主要用于治疗和预防由支原体、金黄葡萄球菌、化脓杆菌、肺炎双球 菌、丹毒杆菌、副嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌、巴氏杆菌、螺旋体、球虫等病原体引起的各 种呼吸道、肠道、生殖道和运动系统感

15、染。并且对预防和治疗畜禽在暴发病毒性疾病时支原 体的继发感染有很好疗效，是世界公认治疗和预防畜禽支原体感染的首选药物，效果优于红 霉素和泰妙菌素。4. 控制细菌耐药性的主要对策364.1普及相关医疗知识，合理使用抗菌药物细菌耐药性的出现主要是在临床上滥用抗生素的结果。特别是在畜禽养殖业中，基层人 员缺乏相关的知识，认为只要加大剂量、延长疗程使用就一定能控制疾病，而全然不考虑药 物的残留和耐药性的产生。因此，应加强基层医务人员的相关医疗知识，用药时要严格掌握 适应症、适当的剂量和疗程，既要避免剂量过大造成的药物浪费和毒性反应的出现，又要注 意剂量不足而导致疾病的复发及耐药性的产生。严格掌握抗菌药

16、物的局部用药、预防用药和 联合用药，避免滥用。在控制动物疾病时尽量减少抗菌药物的使用，最好的方法是改善动物 的饲养条件，防止疾病发生。4.2加强药政管理严格控制抗菌药物的审批、生产标准，加强抗菌药物的质量监督，控制抗菌药物的使用 管理。4.3研制和开发新的药物根据细菌耐药性的发生机制及其与抗菌药物结构的关系，寻找和研制具有抗菌活性，尤 其对耐药菌有活性的新抗菌药；同时可以针对某些因细菌灭活酶而失效的抗菌药物，寻找适 当的酶抑制剂，与抗菌药物联合应用时可保护药物不受灭活酶的破坏而保存其抗菌活性。 4.4开发不使用抗菌药来治疗感染的治疗策略参考文献：1 郝秀红，马聪等.19911999年临床常见病原菌及耐药现状J.中国抗生素杂志，200