完整版目的基因到工程菌的构建

1、目的基因到工程菌的构建1基因工程的诞生1972年，美国斯坦福大学的学者首先在体外进行了 DNA改造的研究， 他们把SV40 （一种猴病毒）的DNA分别切割，又将两者连接在一起， 成功构建了第一个体外重组的人工 DNA分子。1973年，Cohen等人首次 在体外将重组的DNA分子导入大肠杆菌中，成功地进行了无性繁殖，从 而完成了 DNA体外重组和扩增的全过程。在这个的基础上，基因工程诞 生了。FIGURE 1 3 . A Hertxerf Boyer left) and Stanley Cokert. fUc*。=。等/ oFBayer 口cd Sianl&y CohenSV40病毒(0

2、/1)Ori grin of DMA r&plic<3tioru3 HODNA聚合酶 连接酶 外切酶ni VVAVSAAAA5, OP HO3 dT ,% (dTOP 5， n末端转移酶dATP或何 以5r POwaaaa/'OH 3OP51或dTdT/vwva/OH 3'3，HO'Aaaaa/OP 5，n退火 dA 3OH PO5WWWVAAAAAAA/WV* 5f OP HO3y dTdA 3' OH PO5'-AAAAA/WWW第一个重组体的构建1.1 基因工程技术的三大理论基础一是20世纪40年代Avery等人通过肺炎球菌的转化实验

3、证明了生物 的遗传物质是DNA,而且证明了通过 DNA可以把一个细菌的性状转移 给另一个细菌。二是20世纪50年代Watson和Crick发现了 DNA分子的 双螺旋结构及DNA的半保留复制机理。三是20世纪60年代关于遗传信 息中心法则的确立，即生物体中遗传信息是按 DNA- RN牛蛋白质的方向进行传递的1.2 基因工程技术的三大技术基础三大基本技术问题：一是如何从生物体庞大的双链DNA分子中将所需的基因片段切割下来；二是如何将切割下来的DNA片段进行繁殖扩增； 三是如何将所获得的基因片段重新连接。20世纪70年代，由Smith等人 发现的核酸限制性内切酶、DNA连接酶和可以作为基因工程载体

4、的细菌 质粒的发现，解决了上述三大问题。1.2.1 限制性核酸内切酶来源多数来自原核生效作用特点作用结果作用实质形成黏性末端或平末端使特定部位的两个核昔酸之间的磷酸二酯键断开只能识别和切割DNA分子中一 小段特殊的核昔酸序列限制性内切酶不切割自身DNA是因为原核生物中不存在酶的识别序列或 识别序列已经被修饰1.2.2 DNA连接酶作用实质：将具有末端碱基互补的 2个DNA片段连接在一起，形成 重组DNA分子，其起作用时不需要模板。1.2.3 基因工程的载体-质粒基因载体的作用是运载目的基因进入宿主细胞，使之能得到复制和进行表达。也就是说，离开染色体的外源 DNA不能复制，而而插入复制子 DNA

5、的外源DNA可作为复制子的一部分在受体菌中进行复制，这种复制子 是外源基因的载体。止匕外，为满足其使命，还必须具备如下一些特 性：能在宿主细胞内进行独立和稳定的 DNA自我复制，在其DNA插 入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性。易于从宿主细胞 中分离，并进行纯化。载体 DNA序列中有适当的限制性内切酶位点， 并位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA,但不影响载体自身DNA的复制。某些病毒载体在外源 DNA插入后变成缺 损性病毒株，只能在有辅助存在时才能进行正常增殖。 具有能够观察的 表型特征（有报告基因），在插入外源DNA后，这些特征可以作为重组 DNA选择标志

6、。1.3 基因工程的基本过程因：叫 的本堤体:流曰国1.4 基因工程的应用bacteriumBadendl Plasmid chrDmosume©Plasmid isolatedRecombinarii DNA (plasmid)intetest® Gene inserted into plasmidCell containing genF ofDNA Fldsmid put intobacttjh5l ceHRecombinant bactiariumGene for pest resistance inserted into plant(ne uicd Lu alter

7、 bacteria for deafiin up toxic waste Ccll5 dorwd with也ntEin dissolves blood dots inheirta 墉& thempy2目的基因的获取基因工程订是通过人工方法分离、改造、扩增并表达生物的特定基因,从而深入开展核酸遗传研究或者获取有价值的基因产物。 通常我们把插入供体细胞中NU瓯制的许多DNJLfr段卜入运体产入受体细胞产生特定性伏目擒因到载体内那个特定的片段基因称为“外源基因”，而将那些已被或者准备 要被分离、改造、扩增或表达的特定基因或 DNA片段称为“目的基因”。来源于真核细胞的产生基因工程药物的基因是

8、不能直接进行分离的。真核细胞中单拷贝基因只是染色体DNA中很小的一部分，为其 10-5-I。-7,即使多拷贝基因也只有其10-5,因此从染色体中直接分离纯化目的 基因极为困难。另外，真核基因内一般都有内含子，如果以原核细胞作为 表达系统，即便分离出真核基因，由于原核细胞缺乏mRNA的转录后加工系统，真核基因转录的 mRNA也不能加工、拼接成为成熟的 mRNA, 因此不能直接克隆真核基因，必须采用特殊方法分离目的基因。目的基因的获取大致可以分为三类：一是利用 PCR技术甚至化学合成 法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达；二是构建感兴趣的生物 个体的基因组文库或者cDNA文库，即将某生物体的

9、全基因组分段克隆， 然后建立合适的筛选模型从文库中挑出含有目的基因的重组克隆；三是近年来发展的利用基因差异表达获取目的基因 的技术。2.1 直接分离法（鸟枪法）直接从生物细胞基因组中获取目的基因最常用的方法是“鸟枪法”，又称“散弹枪法” 其是将供体生物的DNA用限制酶切割为许多 片段，再用运载体将这些片段都运载到受体 生物的不同细胞中去。只要有一个细胞获得 了需要的目的基因并得以表达，基因工程就算成功了。该法最大的缺点是带有很大的盲目性，工作量大，成功率低。且不能将真核生物的基因转移到原核生物中去。优点是速度快，简单易行，成本较低，并能获得与天然基因组DNA 一样的有内含子的真核基因DNA 片

10、段。2.2 逆转录法（cDNA 法）逆转录法合成DNA 是人工模拟自然界某些生物的反转录过程。主要用于分子量较大而又不知道其序列的基因，它以目的基因的mRNA 为模板，以dNTP为底物，酶催化按5/-3/方向合成一条与RNA模板互补的 DNA 单链（ cDNA） ，它与 RNA 模板形成RNA 与 DNA 的杂交体。随后又在反转录酶的作用下水解掉RNA 链， 再以 cDNA 为模板合成第二条DNA 链。至此，由RNA 指导的 DNA 合成过程完成。新弓I的长出mJ叁fit与力钓H *1.平卜3.工行*1白勺OMA Z R迸分嵇n。弓物也火奴村分户并引物理伸访讣2.3反转录-聚合酶链式反应法（P

11、CR法）该法是将mRNA经反转录全成cDNA的第一链，不需再合成cDNA第二链，而是在特异引物的协助下，用PCR法进行扩增，特异地合成目的cDNA链，用于重组、克隆。常用于含其极微量mRNA的细胞皿加皿in职靖模板 DNAUMeT变性复引物结合到互朴DNA修帆从玉蝴超蛤互朴彼的合成延伸IE1-0汽沿反应厚理示意882.3.1 cDNA 文库cDNA文库是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全部mRNA反转录成cDNA,并全部克隆成重组子，在该重组子群集中包含了其全部表 达基因的转录本。原理是将带 poly (A)的mRNA经酶促反应转变为双 链DNA ,再与原核载体连接。cDNA文库的构建：逆

12、转录酶 核酸酶HDNA聚合酶与载体连接该生物导人受体菌群NA文库mRNA杂交双链单链D、A双链1NA(CDNA) cDN琳一链的合成利用反转录酶合成cDN斓一链 cDNA第二链的合成自身引导合成法：单链cDNA的3'端能够形成发夹状的结构作为引 物，在大肠杆菌聚合酶I Klenow或反转录酶的作用下，合成cDNA的第 二链.此法存在的缺点是在以S1核酸酶切割cDNA的发夹状结构时，会导 致对应于mRNA 5'端的地方的序列出现缺失和重排.OM"IOk AC Min*匕AAA<AL;井井。|>制人t ehna®r>

13、 以*木郑TUNACSATR dTTH dGTP ctCTP置换合成法：以第一链合成产物cDNA: mRNA杂交体作为切口平移 的模板，RNA酶H在杂交体的mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列 RNA引物，在大肠杆菌DNA聚合酶I的作用下合成cDNA的第二链.此 法的优点是：合成cDNA的效率高；直接利用第一链的反应产物，不需 纯化；避免使用S1核酸酶来切割双链cDNA。幅结构5,T叱Hl AAA(A)ndATP dTTP RNAflfiH dGTP 大JK杆菌口 NA聚合酶5,3poly(A >TdCTP；V < WW/WWWX/WWW/W/ T 12 IB 5，X/X

14、7; /X/X/V» /s»Iq,Hl残存的eRna作为合成。DN A第二隹的引物5,3*-WWV> *X/X/WXz> /v/V>5'T 1?-ia3，5'3'T4际菌体ONA连接曲双婕cDNA5 Tin-，日引物-衔接头法Okayama-Berg法合成并克隆双链cDNAPvullJI段IITTTT !J;用 I。 mldMAiH 火Hpa I岫牝Bind inT1"喋热后整时(Hi ijco (df >Pvij IIHi nd IIIiPrat IrnkNAAlAAAA p1TTTTTT- clAlP dCIP

15、(K3TP dl IPHind IHPut I dBell P"t IICCCCCC、 i|IIIbrid III小烟也称胸 I i|4O CdC)PvlfMAAAAAA -=TTTf 11Hi nd Bill一ccnnccQ3GGQG IHi nd IIILm grggggHind III联冰炖化Hi nd IIIccccccPvull MAMA . TTTTTT 以堂QI iso与小口 t 5”11ynNA建火p再以大喊杆希“N八江投岫进桁好牝代NMflfaHAF牌外 nhltNAWAflhtAHiH tVtlJNAil!k*> 4司君植N解潢假GG(i(JtiC.、

16、63;A AAA A A -JTTTTTT . 双链cDNA分子的克隆同聚物加尾法：利用小牛胸腺末端转移酶在双链 cDNA和质粒载体的3,端都加上一个互补的同聚片段， 通过退火使两个片段连接成重组质粒，再将重组质粒转化受体细胞RNAlami* 口 fd”的 川立 fj/AcDNAHAaaAAAA言成eOM第二错ACGTCPat ICT DC AA A *A A* A11VVIWWWWWIWWV' T T T T T T T未J®格拓加dE残举r *班情博博EyGJHi整* wata ac<5 fc .A A A A A A AC CC C CCCCQGCC

17、 BWWWwVwWWWvi TTTTTTT科化"心中MA L时*LJ为京+崎W) I*.从而&，:如阿，/h11忖总接头-衔接头法mRNA-cDNA克隆法方法：在mRNA反转录合成cDNA第一链后，将dA残基加到mRNA : cDNA杂交体上，然后与带dT尾的克隆载体连接，转化受体细胞，在宿 主细胞内，mRNA被降解并代之以 DNA.缺点：克隆的效率低（为双链 cDNA克隆的1/10） cDNA文库的筛选和鉴定核酸杂交1）同源探针；至少含有所需cDNA克隆的一部分确切序列.常用于以一 个部分克隆分离cDNA文库中的全长克隆.2）部分同源探针：探针的序列与所要筛选

18、的 cDNA克隆的序列相关但 不相同.常用于克隆家族基因.3）总cDNA探针：通过反转录酶均匀掺入放射性核甘酸或通过总的或分级分离得到的poly(A)+ mRNA 进行末端标记而获得cDNA 探针 .4) cDNA 扣除探针 : 从第一种mRNA 制备 cDNA 探针 , 连续多次与20 倍过量的第二种mRNA 杂交 ; 回收未杂交的cDNA 探针 , 再与 100倍过量的第一种mRNA 杂交 , 使得原 mRNA 中的一些特异序列得到高度富集.特异性免疫学检测:在 cDNA 表达文库中，目的基因的表达产物能与特异性抗体发生免疫学反应，通过酶学的方法加以检测. cDNA 克隆的同胞检测:将 c

19、DNA 文库分成若干组含有10-100个克隆子的易于处理的cDNA 文库，对每组cDNA 文库进行检测，当鉴定出阳性库后再不断将其分成更细的库进行检测，直到获得阳性单克隆. cDNA 克隆的确证:cDNA 克隆含有编码某一特定蛋白质的完整氨基酸序列的开放读框.1.1.2 基因组文库基因组文库或简称基因文库，其是将某一生物基因组DNA 片段化并全部克隆后所获得的重组子群体的总称。通过构建基因文库可以贮存和扩增特定生物基因工程组的全部或部分片段，同时又能够在需要时从基因文库中调出其中的任何DNA 片段或目的基因。理想的基因组文库应具备下列条件：重组克隆的总数不宜过大，以减轻从文库中筛选目标克隆的工

20、作量。克隆片段大于研究基因的平均片段，以便于从同一克隆中获得完全的单一基因。含有相邻 DNA片段的独立克隆间，部分序列重叠的大小合理，一方面利于基因文库各克隆建立叠连群，进行染色体步查；另一方面，又不重叠过多，使步查效率低下。克隆片段易于从载体分子上完整卸下且最好不带有任何载体序列。重组克隆应能稳定保存、扩增及筛选。该生物基因组文库基因组文库的构建：提取某生物全部DNA用适当 许多与载体连接限制.切割| DNA,段导入受体菌群 细胞染色体大分子 DNA的提取和大片段的制备；载体DNA的制备；载体与外源大片段连接；体外包装及基因组 DNA文库的扩增；重组DNA的筛选和鉴定。?表型筛选法：表达性状

21、易于鉴别，如互补筛选?抗性筛选法：如二氢叶酸还原酶可以使三甲节二氨喀咤降解，而该化学物可抑制大肠杆菌生长?分子杂交法：利用分子探针对文库进行筛选?免疫筛选法：利用多肽等作为抗原进行原位杂交筛选? PCR筛选法：根据保守序列合成引物，扩增特异性片段1.1.3 cDNA文库和基因组文库的区别时效性：cDNA文库代表某一时期特定细胞或组织中 mRAN ,是转录水 平，仅反映某一时期特定组织表达的功能基因， 不是全部基因；而基因组 文库包含该生物所有基因。序列组成不：cDNA文库无间隔序列和调控区等非编码区；基因组文库可真实显示基因组的全部结构信息，由于制备DNA片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含

22、的DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。两种文库均有应用，如何选择：根据试验目的，在分离植物 RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、分离植物特定发育阶段或特特异表达 的基因时应用cDNA文库；在研究mRNA不存在的序列及基因组作图时 必须构建基因组文库。2.4 化学合成法蛋白质的氨 推 niRAX 推 基因dna的 合 目的 基酸顺序测核甘酸序列测核甘酸序列成 基因该方法有个先决条件就是必须已知其核昔酸顺序，或者已知其蛋白质的氨基酸顺序，DNA合成仪再按相应的密码子推导出 DNA的核甘酸序 列。用化学合成此基因DNA不同部位的两

23、条 链的寡核甘酸短片段，再退火成为两端形成 黏性末端的DNA双链片段。然后将这些 DNA片段按正确的次序进行退 火连接起来形成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。常用 于较小分子蛋白质或多肽的合成2.5 物理化学方法其原理是从几个方面来利用核酸 DNA双螺旋之间存在着碱基 G和C配对，T和A配对的这些特性，从而分离目的基因的目的。2.5.1 密谋梯度离心法液体在离心时，其密度随转轴距离而增加。碱基GC配对的双链DNA片段密度较大，利用精密的密度梯度超离心技术可使切割适当片段的不同 DNA按密度大小公布开来。进而通过与某种放射性标志的 mRNA杂交来 检验，分离相应的基因。2.5.2

24、单链酶法碱基GC配对之间有三个氢键，比 AT配对的稳定性高，当用加热或 其他变性试剂处理DNA时，双链上AT配对较多的部位先变成单链，应 用单链特异的S1核酸酶切除单链，殖民地经氯化艳超速离心，获得无单 链切口的DNA。2.5.3 分子杂交法单链DNA与其互补的序列总有“配对成双”的倾向，这就是分子杂 交的原理。其既可以分离，也可以鉴别某一基因。3基因与载体的连接（以质粒为例）3.1 质粒的提取通过加入SDS （十二烷基硫酸钠） 对宿主细胞进行裂解，使质粒DNA顺 利溢出并与染色体DNA和蛋白质等 分离。其中，微量碱变性法提取质粒 具有简单快速、经济实惠优点，是当 前分子生物学及基因工程研究工

25、作中 最常用的一种纯化质粒DNA的方法。当然，也可以采用试剂盒进行，目前，商品化产品很多，其基本原理大多 是基于碱裂解法结合硅胶模等微型离心纯化柱。3.2 质粒载体的构建天然质粒往往存在这样或那样的缺陷，不适合直接用作克隆载体，需要进行人工改造，这些改造主要有以下几方面：（ 1）选择合适的复制起始位点。为了使构建的质粒克隆载体能在受体细胞中进行有效复制，且获得足够数量的拷贝数，需要改变复制起始位点，一般选择组装松散型质粒复制起始位点。（ 2）加入合适的选择标记基因。为了便于重组子筛选，需要在质粒克隆载体上加入合适的标记基因，主要有lacZ 和抗生素抗性基因，前者用于克隆子蓝、白斑筛选；当外源D

26、NA 片段插入到克隆位点后，可导致抗生素抗性基因失活。（ 3）增加或减少酶切位点。质粒载体利用限制性内切酶识别位点来作为外源 DNA 片段插入的克隆位点，这种位点必须是单一酶切位点，而且数量越多越便于多种类型末端的DNA 插入。 可通过删除天然质粒中的部分重复的限制性内切酶识别位点使之成为单一的酶切位点，可通过增加新的单一限制性内切酶位点在特定的部位组装一个含有多种单一限制性内切酶识别序列的多克隆位点（MCS） 。（ 4）缩短长度。质粒转化受体细胞的效率同质粒DNA 分子大小相关，小分子质量质粒转化效率较高。可通过切去质粒上不必要的片段，提高转化宿主细胞的效率，提高其外源DNA 片段的装载量。

27、3.3 目的基因与载体的连接用一定的限制性酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端；再用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量的 DNA连接酶，形成一个重组的DNA分子（重组质粒）。4 重组基因导入受体细胞构建工程菌生物种类细胞植物细胞体细胞将目的基因插 入Ti质粒的DNA动物细胞微生物细胞受精卵原核细胞转化过程上f农杆菌将含有目的基因的表达载体提纯f取卵便导入植物细胞 f整合到受体 细胞的DNA上f表达精卵）f显微注射一受精卵发 育f获得具有 新性状的动物氯化钙处理 细菌细胞f 细菌细胞壁 的通透性增 加f重组质 粒进入宿主 细胞

28、4.1 受体细胞的选择常用的宿主细胞有如下几种： DH5y 用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与pUC编码的P-半乳糖甘酶氨基端实现a互补。HB101:用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高。JM101:可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌。JM109:支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌。MZ-1:温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体PL启动子质粒载体的宿主菌。4.2 重组质粒转化受体细胞常用方法有转化法；转导法；转染法。5筛选含有目的基因的受体细胞原理：质粒上的抗生素的抗性基因方法：利用选择培养基筛选接种筛选所有受体细胞A四环素培养基生活的受体细胞导入

29、.培养重组DNA分子 _ 含重组DNA分子的受体细胞1.1 工程菌筛选方法1.1.1 载体表型选择法载体表型选择法是根据载体分子所提供的表性特征，直接选择重组DNA分子的方法，主要包括： 抗药性标记插入失活选择法pBR322质粒是分子克隆中最常用的一种载体分子，编码有 tetr ampr 使带有该质粒的宿主细胞能在含有四环素或氨节青霉素的培养基中生长。具体做法：将此转化菌先涂布在含有氨节青霉素的平板上，并将存活的菌落原位影印到另一个含有四环素的夹板上，凡是在氨节青霉素平板上生 长，而在四环素夹板上不生长的菌落上就可能是已经获得了这种重组体质 粒的转化子克隆。8 -半乳糖甘酶显色反应选择法除了抗生素抗性筛选之外，质粒等载体上常用的另一种筛选标志是（3-半乳糖甘酶显色反应。当外源 DNA插入到载体lacZ上，导致B -半乳糖 甘酶基因失活，可通过大肠杆菌转化子菌落再添加由 X-gal-IPTG培养基 中的着色变化直接观察出来。1.1.2 根据插入基因的表型选择法其基本原理是：转化进来的外源 DNA编码的蛋白，能够对大肠杆菌 宿主菌株所具有突变发生体内抑制或互补效应， 从而使被转化宿主细胞表现出外源基因编码的表型特征。这种筛选法受到一定的条件限制，他不但要求克隆的D