PCR产物胶回收试验

1、实验六PCR产物胶回收实验一、实验目的1。掌握胶回收的常规操作2。了解胶回收PCR产物的目的二、实验原理利用胶回收试剂盒纯化 PCR产物。本试剂盒提供一个从 TBE或TAE电泳缓冲液配制 的琼脂糖凝胶中提取高质量 DNA的简单、快速、有效的技术，适合从浓度w3% ,高，低熔点琼脂糖凝胶中，回收长度为60bp23Kb的DNA片段，小于100bpDNA片段回收率为10%55%,0。110kbDNA 片段回收率最大为 99%,大于10kbDNA片段回收率为 2070 %。回收的基因组 DNA可以应用到克隆，测序，限制性酶切等各类下游分子生物学 实验。三、试剂及配套设备和材料3.1试剂Extracti

2、on buffer Wash bufferElution buffer3。2配套设备和材料无菌1。5ml离心管各种规格移液器和无菌移液器吸头无水乙醇异丙醇可能需要3M KAc （pH 5.0）离心机四、基本技术参数提取方法操作时间离心柱溶剂提取DNA片段范围洗脱液回收 率"Mt离心柱16分钟内完成2个样本750ul60bp23kb>99%取大400mg 凝胶条适用琼脂糖种类适用电泳缓冲液温育温度高/低熔点琼脂糖TAE/TBE缓冲液50 C （低熔点琼脂糖）55 C （普通琼脂糖）五、操作步骤1.用干净、锋利的手术刀，将含有目的DNA片段的琼脂糖凝胶切下，并放入 1.5或2.0

3、ml离心管中.请尽量切去不包含 DNA片段的凝胶。一般情况下，电泳的DNA上样量A50 ul（50ul为最终洗脱体积）.2 .按1 : 3的比例（凝胶质量毫克数：融胶液体积微升数）加入 Extraction buffer 。例如：100mg凝胶应加入300ul Extraction Buffer 。对于每人份试剂用量，凝胶质 量不能超过400mg。3 .于恒温水浴或金属浴中 50 C温育，直到凝胶融化。一般温育时间为10分钟，温育过程中没隔 23分钟混匀一次。如果温育后，混 合液体颜色变紫，请加入 10 ul 3M KAc （pH 5.0）,使混合液颜色变回黄色.4。可选：按1: 1的比例（凝

4、胶质量毫克数：异丙醇体积微升数）加入异丙醇，并混 合均匀。如DNA片段大于500bp/小于4kb,不需要加异丙醇。5。将混合液全部转移到 Spin column 内，于6,000g离心1分钟，并弃去接液管内 液体。如混合液体积大于750ul可先车移750ul ,其余的液体待离心弃液后，再转移。6 .向 Spin column 内加 500ul Extraction Buffer ,于 12,000g 离心 30 60 秒， 并弃去接液管内液体。7 .向 Spin column 内加 750ul Wash Buffer ，于 12 , 000g 离心 30 60 秒，并弃 去接液管内液体。如果回

5、收的DNA片段将用于盐浓度敏感的实验，请在加入Wash buffer后静置25分钟，再离心。8 .再次于12,000 rpm 离心1分钟，然后将spin column转移到无菌的1。5ml离心管中。如不进行该步离心，则无法保证离心柱内残液被彻底清除。9。向Spin column 内加50ul日ution Buffer 、水或TE溶液,并于室温静置1分 钟。可根据实验的实际需要决定Elution Buffer用量.但不要低于20ul10于12 , 000g离心1分钟，微量离心管内溶液中含有目的DNA片段回收的DNA可直接用于各类下游分子生物学实验，如果不立即使用，请保存于-20 Co六、注意事项1 .为了保证没有外源 DNA的污染，电泳的buffer和gel都是新制的，切胶的台子清理 干净，刀片最好洗净灭菌。2 .为了减少胶的体积，我们可以用相对比较薄的胶来跑电泳，这样可以减少回收试剂引 起的一些后续麻烦.3 .在洗脱前，将洗脱液于