临床免疫学和免疫检验酶免疫技术讲义

1、第九章酶免疫技术第一节酶免疫技术的特点它是将酶与抗体或抗原结合成酶标记抗体或抗原，在酶标抗体（抗原）与抗原（抗体）的特异性反应 完成后，加入酶的相应底物，通过酶对底物的显色反应，对抗原或抗体进行定位、定性或定量的测定分析。一、酶和酶作用底物（一）酶的要求：一个酶蛋白分子每分钟可催化103104个底物分子转变成有色产物。用于标记的酶应符合：1 .酶的活性要强，催化反应的转化率高，纯度高。2 .易与抗体或抗原偶联，标记后酶活性保持稳定，且不影响标记抗原与抗体的免疫反应性。3 .作用专一性强，酶活性不受样品中其他成分的影响，受检组织或体液中不存在与标记酶相同的内源 性酶或抑制物。用于均相酶免疫测定的

2、酶还要求当抗体与酶标抗原结合后，酶活性可出现抑制或激活。4 .酶催化底物后产生的产物易于判断或测量，方法简单易行、敏感和重复性好。5 .酶、辅助因子及其底物对人体无害，酶的底物易于配制、保存，酶及其底物应价廉易得。（二）常用的酶1 .辣根过氧化物酶 （HRP :目前酶联免疫吸附试验中 应用最广泛 的标记用酶。由无色的糖蛋白（主酶） 和亚铁血红蛋白（辅基）结合而成的复合物。辅基是酶活性基团，而主酶则与酶活性无关，HRP的纯度用RZ （HRP分另1J在403nm和275nm处的吸光度比值）表示， RZ值应大于3.0。RZ值仅说明血红素基团在 HRP中的含量，并非表示HRPtiJ剂的真正纯度，而且R

3、Z值高的HRP并不意味 着酶活性也高，RZ值与酶活性无关。酶活性以单位 U表示:即1分钟将1 m mol底物转化为产物所需的酶量。酶变性后，RZ值不变但活性降M,因此使用酶制剂时，酶活性单位比RZ值更为重要。2 .碱性磷酸酶（ALP）:大肠杆菌来源的ALP分子量80kD,酶作用最适 pH为8.0 ;小牛肠黏膜 ALP分 子量为100kD,最适pH为9.6 ;后一种 ALP的活性高于前者。3 . 3 -半乳糖甘酶（3 -Gal ） : 3 -Gal来源于大肠杆菌，分子量 540kD,最适pH68。因人血中缺乏此 以其制备的酶标志物在测定时 不易受到内源性酶的干扰 ，从而提高特异性，被用于 均相酶

4、免疫测定。（三）常用的底物1. HRP的底物（1）邻苯二胺（OPD :是HRPM为敏感的色原底物之一。 OP陈HRP的作用下显橙黄色，加强酸如硫 酸或盐酸 终止反应后呈棕黄色，最大吸U史峰在492nm波长。OPD ELISA中应用最早的底物， 但其应用液稳 定性差，易变色，需新配制后在 1小时内使用,显色反应过程需 成些，而且具有致癌性。 四甲基联苯胺（TMB : TM呢一种优于 OPD勺新型HRPfe原底物。TMBS HRP作用后变为蓝色， 加入硫酸终止反应后变为黄色,最大吸收峰波长为 450ns TMBM有稳定性好，成色 无需避光，无致突变 作 用等优点，已成为目前 ELISA中应用最广泛

5、的底物。缺点是 水溶性差。（3）其他：5-氨基水杨酸（5-ASA）和2, 2-联氮-二（3-乙基-苯并曝陛-6-磺酸）二钱盐（ABTS 。2. ALP的底物常用又-硝基苯磷酸脂（p-NPP） , p-NPP经ALP作用后的产物为 黄色对硝基酚,最大吸收峰波长为 405ns3. B -半乳糖甘酶（B -Gal ）的底物常用4-甲基伞酮基-R-D半乳糖昔（4-MUU）,酶作用后，生成高强度 H光物4-甲基伞形酮（4-MU）, 其敏度性较 HRP高3050倍，但测量时需用荧光计。二、酶标记抗体或抗原酶标记抗体或抗原是指通过化学反应或免疫学反应，让酶与抗体或抗原形成结合物，也称酶标志物或 酶结合物。酶

6、结合物是酶免疫技术的核心组成部分。酶结合物的质量直接影响酶免疫技术的应用效果。（一）酶标记抗体或抗原的制备目前常根据具体方法要求选用单克隆抗体、多克隆抗体经纯化的Ig组分、Ig的Fab'和F （ab' ） 2片段等。酶标记抗体或抗原的方法有多种，标记方法一般应符合：技术方法简单、产率高，且重复性好；标记反应不影响酶和抗原或抗体的活性；酶标志物稳定。标记方法有：1 .戊二醛交联法可以使酶与蛋白质或其他抗原的氨基通过戊二醛偶联。一步法（连接 ALP）,二步法（连接 HRP 。（1） 一步法优点：操作简便、有效，而且重复性好。缺点：交联时分子间的比例不严格，大小也不一，影响效果。（2

7、）二步法先将HR叫戊二醛作用，透析除去戊二醛，在pH9.5缓冲液中再与抗体作用而形成酶标抗体。优点：酶标志物质量较均一，标记效率也较一步法高。2 .改良过碘酸钠法HRP记抗体或抗原的最常用方法 。（二）酶标记物的纯化及鉴定常用的纯化方法有葡聚糖凝胶 G-200/G-150过柱层析纯化和 50%包和硫酸钱沉淀 提纯等。常用免疫电泳 或双相扩散法 进行鉴定。1 .出现沉淀线表示酶标记物中的抗体（抗原）具有 免疫活性。2 .沉淀线经生理盐水漂洗后，滴加酶的底物溶液，若 沉淀线上显色，则酶标记物中的 酶活性仍保留。三、固相载体固相载体是酶免疫技术中将游离和结合的酶标记物迅速分离的最常用方法。（一）固相

8、载体的要求 结合抗体或抗原的容量大；可将抗体或抗原牢固地固定在其表面，经长期保存 和多次洗涤也不易脱落；不影响所固定的抗体或抗原的免疫反应性，而且为使反应充分进行，最好其活性 基团朝向反应溶液，固相方法简便易行，快速经济。（二）固相载体的种类和选择1 .塑料制品：聚苯乙烯塑料最常采用。此种材料具有很好的光透性和蛋白吸附能力，且很容易加工成 试管、微孔板、微球、珠、膜等形状的固相，价格低廉。抗原或抗体以非共价或物理吸附 方式结合到此载体上。2 .微粒：可悬浮在溶液中，带有能与蛋白质结合的功能基团，形成化学偶联。自动化检测中常用。3 .膜载体：常有硝酸纤维素膜（Nc）、玻璃纤维素膜及尼龙膜等通过

9、非共价键吸附抗体（抗原），广 泛用于定性或半定量斑点 ELISA的固相载体。（三）包被与封闭1 .包被：将抗原或抗体结合在固相载体上的过程 。普遍使用的 聚苯乙烯 载体,通常将抗原或抗体溶于 缓冲液（常用为pH9.6的碳酸盐缓冲液）中，加于 ELISA板孔中4c过夜。包被好的固相载体在低温可放置 一段时间而不失去免疫活性。2 .封闭：包被的蛋白质浓度过低，固相载体表面不能被此蛋白质完全覆盖，其后加入的血清标本和酶 结合物中的蛋白质也会部分地吸附于固相载体表面，最后产生非特异性显色致本底偏高，在这种情况下， 需用1%- 5%勺牛血清白蛋白或 5%-20%|、牛血清再包被一次，消除此干扰，此过程称

10、为封闭。第二节酶免疫技术的分类包括两种：酶免疫组织化学 技术:用于组织切片或其他标本中抗原的定位。酶免疫测定技术（EIA）:用于 液体标本中抗原或抗体的定性和定量。EIA是用酶标记抗原或抗体作标志物用于检测液体样品中可溶性抗原或抗体含量的微量分析技术。EIA反应系统中，酶标抗体（抗原）经反应后，可与相应的抗原（抗体）形成免疫复合物，通过测量复合物中标记酶催化底物水解呈色的颜色深浅， 可以推算待测抗原或抗体含量。根据抗原抗体反应后是否需将结合和游离的酶标志物分离 ，EIA一般可分为 均相和异相两种类型。均相酶免疫测定利用酶标志物与相应的抗原或抗体结合后，标记酶的活性会发生改变的原理，可以在不将结

11、合和游离 酶标志物分离的情况下，通过测定标记酶的活性的改变，而确定抗原或抗体的含量。该法主要用于小分子激素和半抗原（如药物）的测定,均相法的优点是适合于自动化测定，但反应中被抑制的酶活力较小，需用灵敏的光度计测定，反应的温度也需严格控制。（一）酶放大免疫测定技术（EMIT） EMIT的基本原理是半抗原与酶结合成酶标半抗原。当与抗体结合 后，所标的酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受到影响而活性被抑制。反应后酶活力大小与标本中的半 抗原量呈一定的比例，从酶活力的测定结果就可推算出标本中半抗原的量。（二）克隆酶供体免疫分析（ CDEIA DNA重组技术可分别合成某种功能酶（如3-D半乳糖甘酶）分子的

12、两个片段，大片段称为酶受体（EA），小分子称彳酶供体（ED）,两者单独均无酶活性，一定条件下结合形成四聚体方具酶活性。克隆酶供体免疫测定（CDEIA）的反应模式为竞争法。二、异相酶免疫测定是目前应用最广泛 的一类标记免疫测定技术。（一）异相液相酶免疫测定主要用于检测样品中极微量的 短肽激素和某些药物等小分子半抗原。酶标志物具有更好的稳定性，且无放射性污染。异相液相酶免疫测定根据样品抗原加样顺序及温育反应时相不同而有平衡法和非平衡法两种。（二）固相酶免疫测定 酶联免疫吸附试验（ELISA）。 第三节酶联免疫吸附试验一、基本原理把抗原或抗体结合到固相载体表面，测定时将受检样品和酶标记抗原或抗体按一

13、定程序与结合在固相 载体上的抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物；洗去未结合成分；加入底物后，底物被固相载体上的酶催 化变成有色产物。故： 固相的抗原或抗体；酶标记的抗原或抗体；酶反应的底物三种试剂为反应必备。ELISA广泛用于传染病的诊断，病毒如肝炎病毒（甲肝抗体、“乙肝两对半”、丙肝抗体、丁肝抗体、 戊肝抗体）、风疹病毒、疱疹病毒、轮状病毒等；细菌如结核分枝杆菌、幽门螺杆菌等。也用于一些蛋白 质检测，如各种免疫球蛋白、补体、肿瘤标志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特异性抗原等）。二、方法类型及反应原理根据其测定抗原和抗体的不同而有不同的测定方法，抗原测定：蛋白大分子抗原用得最多的是双抗体 夹心法

14、，而对于只有单个抗原决定簇的小分子，则使用竞争抑制法。抗体测定：通常使用间接法、双抗原 夹心法、竞争法和捕获法等。（一）检测抗原的方法1 .双抗体夹心法：属于非竞争结合 ，检测含有至少两个抗原决定簇的多价抗原。原理是先将特异性抗 体与固相载体连接；加入待测标本，形成固相抗原抗体复合物；再加入酶标抗体形成双抗体夹心，洗涤; 加底物显色，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量检测。2 .双位点一步法：在双抗体夹心法基础上发展而来。针对抗原分子上两个不同且空间距离较远的决定g,包被使用一种单抗，酶标记使用另一种单抗。测定时将待测抗原和酶标抗体同时加入，温育、洗涤， 加入底物显色。若待测抗原浓度过高

15、时，过量的抗原可分别同固相抗体和酶标抗体结合而抑制夹心复合物 的形成，出现钩状效应，显色降低，甚至假阴性。必要时可将标本经过适当稀释后重复测定。3 .竞争法用于测定小分子抗原。原理为先用抗小分子的特异性抗体包被固相，然后同时加入待测样本和酶标记的小分子，两种小分子竞争与固相上的抗小分子的特异性抗体结合,温育一定时间后洗涤，加入酶底物显 色。特点是：酶标记抗原与样品或标准品中的非标记抗原具有相同的与固相抗体结合的能力；反应体 系中，固相抗体和酶标抗原是固定限量 ，且前者的结合位点少于酶标记和非标记抗原的分子数量和；免 疫反应后，结合于固相载体上复合物中被测定的酶标抗原的量（酶活性）与样品或标准品

16、中非标记抗原的 浓度成反比。（二）检测抗体的方法1 .间接法：最常用的方法，属非竞争性结合试验。原理：将抗原包被在固相载体上，加入待测样本形 成固相抗原-受检抗体复合物；经温育洗涤后，加入酶标二抗，常用羊抗人igG,在固相上即形成固相抗原 -待测抗体-酶标抗抗体复合物，加入底物后根据显色的深浅确定待测抗体含量。多用于检测igG类型抗体。此外，该法只需更换固相抗原，就可用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体，具有更广的通用性。但此法由于受血清中高浓度的非特异性IgG的干扰，通常待测标本需经一定稀释后才能测定。2 .双抗原夹心法此法可检测各类抗体，因此双抗原夹心法的 灵敏度和特异性要高于间接法

17、。其原理类似双抗体夹心法， 操作步骤也基本相同，也可采用一步法，只不过由于机体产生抗体IgG的效价有限，一般不会出现钩状效叵。3 .竞争法一般抗体检测是较少采用，当相应抗原材料中含有与抗人IgG反应的物质，而且不易得到足够的纯化抗原或抗原的结合特异性不稳定时，可采用这种方法测定抗体，目前临床运用较多的是乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）和乙型月f炎病毒 e抗体（HBeAb的检测。抗体的竞争法测定不同于单个抗原决定簇的小分子抗原的竞争法，其测定的可靠性主要受竞争抗体的 特异性和亲和力影响，竞争抗体与待测抗体的特异性及亲和力越接近，则测定的可靠性越强，但竞争用的 抗体均为相应抗原免疫动物所得，与机

18、体感染病毒后所产生的抗体肯定会有所差异，因此在目前HBeAb和HBcAb的临床检测中，常有难以解释的结果出现，这与其在方法学上的缺陷是有关的。4.捕获法又称反向间接法主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定，目前 最常用的是病原体急f感染诊断中的IgM型抗体。原理：先将针对IgM的二抗包被于固相载体，加入待测标本，其中 IgM类抗体可被固相抗体捕获， 再加入特异性抗原，其与固相上捕获的IgM抗体结合后，加入酶标记特异性抗原的抗体，形成固相二抗-IgM- 抗原-酶标记抗体复合物，加底物显色后，即可对待测标本中IgM是否存在及含量进行测定。【习题】目前酶免疫技术中应用较广、提纯较简便的酶是

19、A.月尿酶B.碱性磷酸酶C.葡萄糖氧化酶D.辣根过氧化物酶E.半乳糖昔酶正确答案D答案解析HRP目前在酶联免疫吸附试验中应用最为广泛的标记用酶。酶放大免疫测定技术（EMIT）主要用来检测A.抗原B.抗体C.半抗原D.不完全抗体E.抗原抗体复合物正确答案C答案解析酶放大免疫测定技术（EMIT）主要用来检测半抗原。以下关于酶标记抗体或抗原不正确的是A.过碘酸盐氧化法只用于HRP勺标记B.未标记上的游离的抗体与酶标记抗体竞争固相上的抗原C.制备的标记物无须纯化，因为游离的酶或未标记上的抗原或抗体成分在测定过程中被洗掉D.制备的结合物需要纯化E.标价物需要鉴定正确答案C答案解析每批制备的酶标志物都要进

20、行质量和标记率的鉴定，质量鉴定包括酶活性和抗体（抗原） 的免疫活性鉴定。常用免疫电泳或双相扩散法，出现沉淀线表示酶标记物中的抗体（抗原）具有免疫 活性。沉淀线经生理盐水反复漂洗后，滴加酶的底物溶液，若在沉淀线上能显色，则表示酶标记物中 的酶活性仍保留。也可直接用 ELISA方法测定。关于酶联免疫吸附试验（ELISA）错误的是A.属于液相和固相酶免疫测定B.固相常用聚苯乙烯反应板C.通过洗涤除去未结合成分D.底物显色E.既能定性又能定量分析正确答案 A答案解析酶联免疫吸附试验（ELISA）属于固相酶免疫测定。酶免疫技术中最常用的固相载体是A.聚氯乙烯B.聚苯乙烯C.硝酸纤维素膜D.琼脂糖E.尼龙

21、膜正确答案B答案解析酶免疫技术中最常用的固相载体是聚苯乙烯。酶免疫技术中悬浮在溶液中具有液相反应速率的固相载体是A.聚氯乙烯B.聚苯乙烯C.硝酸纤维素膜D.磁性微粒E.尼龙膜正确答案D答案解析酶免疫技术中悬浮在溶液中具有液相反应速率的固相载体是磁性微粒。将抗原或抗体固相化的过程称为A.吸附B.包被C.封闭D.标记E.交联正确答案B答案解析将抗原或抗体固相化的过程称为包被。ELISA技术中，最常用来检测抗体的方法是A.双抗体夹心法B.间接法C.竞争法D.捕获法E.应用生物素和亲和素的 ELISA正确答案B答案解析ELISA技术中，最常用来检测抗体的方法是间接法。下列有关双位点一步法 ELISA的

22、叙述中，错误的是A.使用针对同一抗原不同决定簇的两种单克隆抗体作为酶标抗体B.一种单克隆抗体作为固相抗体，另一种作为酶标抗体C.采用高亲和力的单克隆抗体将提高测定的敏感性和特异性D.可使标本和酶标抗体同时加入E.标本中抗原过高时，会出现钩状效应正确答案 A答案解析双位点一步法：在双抗体夹心法基础上，进一步发展了双位点一步法。该法是针对抗原 分子上两个不同且空间距离较远的决定簇的两种单克隆抗体，即包被使用一种单抗，酶标记使用另一 种单抗。测定时将含待测抗原标本和酶标抗体同时加入进行反应，两种抗体互不干扰，经过一次温育 和洗涤后，即可加入底物进行显色测定。但当待测抗原浓度过高时，过量的抗原可分别同固相抗体和 酶标抗体结合而抑制夹心复合物的形成，出现钩状效应( hook effect ),显色降低，严重时可出现假 阴性结果。必要时可将标本经过适当稀释后重复测定。这是应用此法必须要注意的问题。ELISA技术中待测孔(管)显色颜色的深浅与待测抗原或抗体呈负相关的是A.双抗体夹心法B.双位点一步法C.间接法测抗体D.竞争法E.捕获法正确答案D答案解析ELISA技术中待测孔