紫外-可见分光光度法标准操作规程

1、*有限公司文件名称文件编码ZL-SOP-022-01紫外-可见分光光度 法标准操作规程制定人日期审核人日期审核人日期批准人日期颁发部门质量管理科分发数量份生效日期分发部门：质量管理科、中心化验室1 .目的：规范紫外-可见分光光度法检验操作，保证检验的质量。2 .范围：适于本公司紫外-可见分光光度法操作。3 .责任：质量管理科、中心化验室、检验员。4 .检验依据：中国药典2015年版四部紫外-可见分光光度法操作方法。5 .内容：5.1 简述分光光度法是通过被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸光度 或发光强度，对该物质进行定性和定量分析的方法。定量分析通常选择物质的最大吸收波长处测出吸光度，

2、 然后用对照品或百 分吸收系数求算出被测物质的含量，多用于制剂的含量测定；对已知物质定性可用吸 收峰波长或吸光度比值作为鉴别方法； 若化合物本身在紫外光区无吸收，而杂质在紫 外光区有相当强度的吸收，或杂质的吸收峰处化合物无吸收，则可用本法作杂质检查。物质对紫外辐射的吸收是由于分子中原子的外层电子跃迁所产生的，因 此，紫外吸收主要决定于分子的电子结构， 故紫外光谱又称电子光谱。有机化合物分 子结构中如含有共腕体系、芳香环或发色基团，均可在紫外光区(200-400nm)或可*有限公司文件名称紫外-可见分光光度法标准操作规程文件编码ZL-SOP-022-01见光区（400-760nm）产生吸收。通常

3、使用的紫外-可见分光光度计的工作波长范围为 190-900nm,因此又称紫外一可见分光光度计。紫外吸收光谱为物质对紫外区辐射的能量吸收图。朗伯 -比尔（Lambert Beer）定律为光的吸收定律，它是紫外-可见分光光度法定量分析的依据，其数学表 达式为：1A = lg = EC T 式中M吸收度；T为透光率；E为吸收系数；C为溶液浓度；L为光路长度。如溶液的浓度（C）为1% （g/ml）,光路长度（L）为1cm相应的吸收系 数为百分吸收系数，以可（%表示。如溶7的浓度（C）为摩尔浓度（mol/L）,光路长 度为1cnW,则相应有吸收系数为摩尔吸收系数，以e表示。5.2 仪器紫外-可见分光光度

4、计主要由光源、单色器、样品室、检测器、记录仪、 显示系统和数据处理系统等部分组成。为了满足紫外一可见光区全波长范围的测定，仪器备有二种光源，即笊灯 和鸨灯，前者用于紫外区，后者用于可见光区。单色器通常由进光狭缝、出光狭缝、平行光装置、色散元件、聚焦透镜或 反射镜等组成。色散元件有棱镜和光栅二种，棱镜多用天然石英或熔融硅石制成， 对 200400nn«H光的色散能力很强，对600nmz上波长的光色散能力较差，棱镜色散 所得的光谱为非匀排光谱。光栅系将反射或透射光经衍射而达到色散作用，故常称为 衍射光栅，光栅光谱是按波长作线性排列，故为匀排光谱，双光束仪器多用光栅为色 散元件。检测器有光

5、电管和光电倍增管二种。5.3 紫外-可见分光光度计的检定波长准确度*有限公司文件名称紫外-可见分光光度法标准操作规程文件编码ZL-SOP-022-01波长准确度的允差范围双光束光栅型紫外-可见分光光度计波长准确度允许误差为± 0.5nm。单光束棱镜 型350 nmM ± 0.7nm, 500nmi ± 2.0nm, 700nmi ± 4.8nm。波长准确度检定方法?用低压汞灯检定（1）关闭仪器光源，将汞灯（用笔式汞灯最方便）直接对准进光狭缝，如为双光 束仪器，用单光束能量测定方式，采用波长扫描方式，扫描速“慢”（如15 nm/min）、 响应“快”、最小

6、狭缝宽度（如0.1nm）、量程0100%在200800nnffi围内单方向 重复扫描3次，由仪器识别记录各峰值（若仪器无“峰检测”功能，必要时可对指定 波长进行“单峰”扫描）。（2）用于检定紫外-可见分光光度计的汞灯谱线波长 L: 237.83、253.65、275.28、 296.73、302.15、313.16 、334.15、365.02、365.48、366.33、404.66 （紫色）、435.83 （蓝色）、546.07 （绿色）、576.96 （黄色）及 579.07nm。?用仪器固有的笊灯检定本法主要用于日常工作中波长准确度的核对。取单光束能量测定方式，测量条件同上述低压汞灯的

7、方法，对486.02及656.10nm二单峰进行单方向重复扫描3次。?用氧化钦玻璃检定（1）将氧化钦玻璃放入样品光路，参比光路为空气，按测定吸收光谱图方法测定。 校正自动记录仪器时，应考虑记录仪的时间常数，测定样品与校正时取同一扫描速度。（2）氧化钦玻璃在 279.4 , 287.5, 333.7, 360.9, 418.7, 460.0, 484.5, 536.2 及637.5nm波长处有尖锐的吸收峰，可供波长检定用。氧化钦玻璃因制造的原因，每 片氧化钦的吸收峰波长有差异，应使用经计量部门校验过的。?用高氯酸钦溶液检定本法可供没有单光束测定功能的双光束紫外-可见分光光度计波长准确度检定 用。

8、（1）高氯酸钦溶液的配制方法：取10%氯酸为溶剂，加入氧化钦（HqO）配成4% 溶液即得。（2）高氯酸钦溶液较强的吸收峰波长为 241.13,278.10,287.18,333.44,345.47 , 361.31, 416.28, 451.30, 485.29, 536.64, 640.52 nm。*有限公司文件名称紫外-可见分光光度法标准操作规程文件编码ZL-SOP-022-01（3）如果是双光束扫描仪器，但不是数据贮存型的（指是直接将信号描记于记录 纸上），记录的波长可能因记录笔滞后而非真实波长，为了准确测定，建议采用定点 检定而不用扫描方式。吸光度准确度精密称取在120c干燥至恒重的基

9、准重铭酸钾约 60mg置1000ml量瓶中， 用硫酸液（0.005mol/L ）溶解并稀释至1000ml ,用配对的1cm石英池，以硫酸液 （0. 005mol/L）为空白，在235, 257, 313, 350 nm别测定吸光度，然后换算成E1% 测得值应符合下表中规定的允差范围（土 1%。分光光度法允差范围波长（nm吸光强度吸收系数（E1%M允差范围235最小124.5123.3 125.7257最大144.0142.6 145.4313最小48.6248.13 49.11350最大106.6105.5 107.7分辨率、杂散光、基线平直度、稳定度、绝缘电阻等项检定，按中华人 民共和国国家

10、计量检定规程JJG682-90双光束紫外-可见分光光度计检定规程执 行，并应符合有关项下的规定。日常常规测定主要是对波长准确度和吸光度准确度时常检查。5.4 样品测定操作方法吸收系数测定（性状项下）按各该品种项下规定的方法配制供试品溶液， 在规定的波长（参见5.8项） 测定其吸光度，并计算吸收系数，应符合规定范围。鉴别及检查按各该品种项下的规定，测定供试品溶液在有关波长处的最大及最小吸 光，有的并须测定其各最大吸光峰值或最大吸光与最小吸光的比值，均应符合规定。含量测定对照品比较法*有限公司文件名称紫外-可见分光光度法标准操作规程文件编码ZL-SOP-022-01按各该品种项下规定的方法，分别配

11、制供试品溶液和对照品溶液， 对照品溶液中 所含被测成分的量应为供试品溶液中被测成分标示量的 (100± 10) %以内，用同一溶 剂，在规定的波长处测定供试品溶液和对照品溶液的吸光度。吸收系数法?按各该品种项下配制供试品溶液，在规定的波长及该波长土 1nmt测定其吸光度，按各该品种在规定条件下给出的吸收系数计算含量。?采用吸收系数法应对仪器进行校正后测定，如为测定新品种的吸收系数，需按“吸收系数测定法”的规定进行。计算分光光度法采用计算分光光度法的品种，应严格按各该品种项下规定的方法进行， 用本法时 应注意：有一些光收度是在供试品或其成分吸收曲线的上升或下降陡坡部处测定，影响精度的因

12、素较多，故应仔细操作，尽量使测定供试品和对照品的条件一致， 若该品 种不用对照品，如维生素A测定法(见中国药典附录)，则应在测定前对仪器作仔细 的校正和检定。5.5 注意事项试验中所用的量瓶，移液管均应经检定校正、洗净后使用。使用的石英吸收池必须洁净。用于盛装样品、参比及空白溶液的吸光池， 当装入同一溶剂时，在规定波长测定吸光池的透光率，如透光率相差在0. 3%Z下者可配对使用，否则必须加以校正。取吸光池时，手指拿毛玻璃面的两侧。装盛样品溶液以池体积的4/5为度，使用挥发性溶液时应加盖，透光面要用擦镜纸由上而下擦拭干净，检视应无残留溶剂， 为防止溶剂挥发后溶质残留在池子的透光面，可先用蘸有空白

13、溶剂的擦镜纸擦拭，然 后再用干擦镜纸拭净。吸光池放入样品室时应注意每次放入方向相同。 使用后用溶剂 及水冲洗干净，晾干防尘保存，吸光池如污染不易洗净时可用硫酸发烟硝酸 (3:1V/V) 混合液稍加浸泡后，洗净备用。如用铭酸钾清洁液清洗时，吸光池不宜在清洁液中长 时间浸泡，否则清洁液中的铭酸钾结晶会损坏吸收池的光学表面， 并应充分用水冲洗， 以防铭酸钾吸附于吸光池表面。测定前应先检查所用的溶剂在测定供试品所用的波长附近是否符合要求， 可用1cm&英吸光池盛溶剂以空气为空白(即参比光路中不放置任何物质)测定其吸*有限公司文件名称紫外-可见分光光度法标准操作规程文件编码ZL-SOP-022-

14、01光度，应符合下表规定。以空气为空白测定溶剂在不同波长处的吸光度的规定波长范围（nm220240241250251300300以上吸光度<0.4<0.2<0.1<0.05所用溶剂应不超过其截止使用波长。每次测定时应采用同一厂牌批号，混合均匀的l批溶剂。称量应按药典规定要求。配制测定溶液时稀释转移次数应尽可能少，转移 稀释时所取容积一般应不少于5ml。含量测定供试品应称取2份，如为对照品比较法， 对照品一般也应称取2份。吸收系数检查也应称取供试品2份，平行操作，每份结果对 平均值的偏差应在土 0. 5%Z内。作鉴别或检查可取样品1份。吸收池，当装入同一溶剂时，在规定波长

15、测定吸收池的透光率， 如透光率相差在 0. 3%Z下者可配对使用，否则必须加以校正。供试品测试溶液的浓度，除各该品种项下已有注明者外，供试品溶液的吸 光度以在0. 3-0. 7之间为宜，吸光度读数在此范围误差较小，并应结合所用仪器吸 收度线性范围，配制合适的读数浓度。选用仪器的狭缝谱带宽度应小于供试品吸光带的半宽度，否则测得的吸光度值会偏低，狭缝宽度的选择应以减小狭缝宽度时供试品的吸光度不再增加为准，对于中国药典紫外测定的大部分品种，可以使用 2nmi宽，但对某些品种如青霉素钾及 钠的吸光度检查则需用1nmi宽或更窄，否则其264nm勺吸光度会偏低。测定时除另有规定者外，应在规定的吸光峰土 2

16、nmt,再测几点的吸光度， 以核对供试品的吸光峰位置是否正确，并以吸光度最大的波长作为测定波长，除另有 规定外吸光度最大波长应在该品种项下规定的波长土1nmz内，否则应考虑试样的同一性、纯度以及仪器波长的准确度。5.6 结果计算对照品比较法可根据供试品溶液及对照品溶液的吸光度与对照品溶液的浓度以正比法算出供试品溶液的浓度，再计算含量。A样品：A寸照=C羊品：G寸照*有限公司文件名称紫外-可见分光光度法标准操作规程文件编码ZL-SOP-022-01C样品=A样品X G寸照/ A对照式中A为吸光度值；C为测试液浓度（以mg/ml计）。吸收系数法中国药典规定的吸收系数，系指E11CM即在指定波长时，

17、光路长度为1cm,试样浓度换算为1%（g/ml）时的吸光度值，故应先求出被测样品的 E11CM,再与规定的E1CM比较，可计算出供试样品的含量品）C X L式中A为供试品溶液测得的吸光度值;C 为供试品溶液的百分浓度，即100ml中所含溶质的克数（g/ml ）；为吸光池的光路长度（cm） 。品）一义 100e/cM供试样品的含量% =e1CM 准）式中e 1CM品）为根据前式计算出的供试品的百分吸收系数；e1CM准）为药典或药品标准中规定的百分吸收系数。5.7 吸收系数测定法本法主要用于新品种的吸收系数测定。测定方法取精制样品精密称取一定量，使样品溶液配成吸光度读数在 0. 60. 8 之间，置1cn®光池中，在规定波长处按5. 8项的规定测出读数，然后再用同批溶剂 将溶液稀释1倍，使吸光度在0. 30. 4之间，再按上述方法测定。样品应同时测定 2 份，同一台仪器测定的2份结果，对平均值的偏差应不超过上0. 3%否则应重新测定。 测定时，先接仪器正常灵敏度测试，然