试验报告2荧光分光光度法测定维生素B2的含量

1、实验项目：荧光分光光度法测定维生素 B2的含量【实验题目】荧光分光光度法测定维生素 B2的含量【实验目的】1、掌握标准曲线法定量分析维生素B2的基本原理。2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。 【实验原理】其结构式为： 0OlNHM UN一。HQ/J-1 _OH的荧光时溶液要控制在酸性范围F = 2.303 Io bc维生素B2（又叫核黄素，VB2）是橘黄色无臭的针状结晶。 由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此 它能够发射荧光。维生素B2易溶于水而不溶于乙醛等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳 定。维生素B2溶液在430440nm蓝光的照射下

2、，发出绿 色荧光，荧光峰在535nm附近。维生素B2在pH= 67的 溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。维生素 B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而 转化为另一物质一一光黄素，光黄素也是一个能发荧光的 物质，其荧光比维生素 B2的荧光强得多，故测维生素B2内，且在避光条件下进行。在稀溶液中，荧光强度 F与物质的浓度c有以下关系：当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系：F=Kc这是荧光光语法定量分析的依据。【主要仪器与试剂】主要仪器：F-2500 HiTachi荧光分光光度计；1cm石英皿；50mL容量并瓦;

3、5mL移液管；烧 杯；胶头滴管 试剂：维生素 B2标准溶液：未知液 4【实验内容及步骤】1、系列标准溶液的制备取维生素 B2 标准溶液（10.0 科 g/mL）1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL 分别置 于50mL的容量瓶中，各加入去离子水稀释至刻度，摇匀。标记为的一系列维生 素B2标准溶液。待测。2、待测液制备取5.00mL未知液4置于50mL容量瓶中，加入去离子水稀释至刻度，摇匀。待测。3、激发光谱和荧光发射光谱的绘制设置入em= 540nm为发射波长，在250500nm范围内扫描标准溶液，记录荧光发射强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。从激发光谱图

4、上找出其最大激发波长入ex。在此激发波长下，在 400600nm范围内扫描，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便 得到荧光发射光谱。从荧光发射光谱上找出其最大荧光发射波长入emo4、标准溶液及样品的荧光测定将激发波长固定在最大激发波长入ex,荧光发射波长固定在最大荧光发射波长处入emo扫描蒸储水和上述 5个标准液的荧光发射强度。数据记录于表1中。以溶液的荧光发射强度 为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线。在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓度，计算待测样品溶液中的维生素B2的含量。【数据记录与结果分析】、维生素B2激发光谱图：最大激发波长入ex

5、=373nm、维生素B2荧光发射光谱图:最大荧光发射波长处入 em=524nm表1:标准溶液及待测溶液的浓度和荧光强度数据记录:维生系B2溶液浓度/ （1 g/mL ）0.0000.2000.4000.6000.8001.000相对荧光强度0.23424.6548.0070.5091.86112.9、系列标准溶液浓度与荧光发射强度的标准曲线图:相关系数r=则待测溶液的浓度 c =0.907 g g/mL【问题讨论】1、试解释荧光光度法较吸收光度法灵敏度高的原因？答：原因是由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，并且荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定的灵敏

6、度提高；而吸收光度法测 定的是吸光度，不管是增大入射光强度，还是提高检测器的灵敏度，都会使透射光信号 与入射光信号以同样的比例增大，吸光度值不会改变，因此灵敏度不能提高。2、维生素B2在pH=67时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定？HD1D|non口!X%4 -IZWOrrilk-n现1!口口门i nii I JIJ好的JW.见褥 IEI ECT DH)GM 4l 30Dfin1旧“加 ， jmjij 口再。卜取135、|”二Fji司F1,W1371 1IT, H5 ST- MJi-siJ-w QB= *1 |f irDEFUUMHllj EQwJi 弗 j n-wra . (F MEm 值 l| Ent TJj由计算机处理得标准