2012CB966500非整合人诱导性多能干细胞iPS及相关技术用于β地中海贫血治疗的研究

1、工程名称：非整合人诱导性多能干细胞iPS及相关技术用于B地中海贫血治疗的研究首席科学家：潘光锦 中国科学院广州生物医药与健康研究院起止年限： 2022.1至2022.8依托部门：中国科学院一、关键科学问题及研究内容1、平安高效,具有临床实用性的非整合iPS新技术的优化及建立.平安高效获得非病毒非整合iPSC的新技术建立综合的诱导系统获得非病毒非整合的iPSC:利用mRNA及microRNA诱导体细胞获得iPSC,筛选能够加速iPSC重编程的小分子化合物及蛋白；筛选 高效的iPSC诱导培养液.在此根底上,建立综合的诱导系统获得非病毒非整合 的 iPSC.iPSC的鉴定：核型、基因表达、体外分化水

2、平、体内多能性检测等多方面检测iPSC是否符合干细胞的标准；分子水平检测外源基因的插入；测序分析iPSC 的基因组稳定性.建立非病毒非整合小鼠ESC羊的人类iPSC (ESC-like-iPSC )筛选能够稳定培养ESC-like-iPSC的培养环境：通过传统的病毒诱导获得小鼠ESC羊的人类iPSC (ESC-like-iPSC );筛选小分子化合物稳定培养ESC-like-iPSC ;筛选 mRNA 及microRNA 支持ESC-like-iPSC 的自我更新；建立非病毒非整合ESC-like-iPSC :开发诱导获得ESC-like-iPSC的诱导系统；在全基因组表达、小RNA表达等方面

3、比拟两种不同的iPSC的差异.2、利用体外受精胚胎建立多株正常人及地贫病人的EM田胞系.比照地贫iPS及ES,评价iPS多能性,平安性等应用指标.建立非整合B地中海贫血病人iPS细胞库,约含各突变类型B地中海贫血iPS 细胞株50100株.优化和完善建立人胚胎干细胞的技术体系,并在此根底上建立地贫胚胎干细 胞库.本研究拟对现有的胚胎干细胞培养技术进行改良： 利用不同发育阶段的IVF废弃的胚胎(从桑根胚到孵出的晚期囊胚)别离的人ESC细胞进行均一性研究,寻找最优化的细胞别离时间；通过对人源性的饲养层细胞及无饲养层培养体系进 行优化,建立平安、稳定的人胚胎干细胞系技术平台.并在此根底上,建立不同

4、突变类型B地中海贫血人胚胎干细胞株10株以上.非整合B地中海贫血病人iPS细胞与地贫胚胎干细胞比拟性研究.比照研究地 贫ES及iPS,建立其表观遗传和基因表达的数据库.利用基因芯片及高通量DNA测序技术,比照检测地贫iPS与ESftSNP, DNA 甲基化(DNA methylation), 组蛋白修饰(Histone Modification) ,外显子序列(Exon Sequencing) 等方面的 差异.全面评价iPS在全能性,表观遗传学,基因组完整性,相关功能性细胞分 化的水平等,明确造血分化用iPS的全能性,平安性等应用标准.3、研究修复地贫iPS的突变基因.探讨和评价经基因修复等操

5、作 后iPS的基因组及表观遗传的稳定性,多能性及平安性等指标.建立 多样性的非整合地贫iPS细胞库.利用基因重组技术修复突变基因.基因修复后iPS基因组及表观遗传学稳定 性的研究.通过基因芯片的技术手段检测基因修复后iPS的SNP, CNV等代表基因组稳定性的指标.并进行外显子测序(Exon Sequencing)来确定有无重要基因 发生突变等.利用CHIP结合高通量测序技术确定经体外基因修复后的iPS在组蛋 白修饰,DNA甲基化等表观遗传方面的稳定性.基因修复后iPS多能性的维持.研究经体外基因操作后,iPS维持其多向分化 潜能的水平.通过非定向的分化手段如裸鼠体内畸胎瘤的形成, 体外类胚胎

6、(EB) 的形成等手段比照基因修复前后地贫iPS的分化潜能.并通过定向分化的方式如, 神经分化,血液分化等比照探讨iPS在基因修复过程中的多能性维持.4、iPS功能性血液分化的研究及基于动物模型的功能评价.利用与不同人造血组织来源的的基质细胞,包括间充质干细胞共培养系统,优化建立iPS的功能性血液分化及造血干、祖细胞体外扩增实用性技术.建立基 于动物模型的造血干细胞分化,移植及平安性多功能的评价技术和指标.采用不同造血组织来源人间充质细胞与人胚胎干细胞及iPS细胞共培养诱导造血分化,与目前较常用的EB形成及小鼠或其它组织来源的基质细胞共培养体 系进行诱导效率的比拟,筛选有效提升造血干细胞诱导效

7、率的iPS细胞分化培养条件.利用体外细胞长周期培养、单细胞培养分化实验以及体内NOD/SCID鼠造血重建实验、骨髓竞争移植实验等,与脐带血HSC细胞比拟,评价多种来源的iPS分化来源的HSC/HPC体内定向归巢、造血重建等生物学功能.比拟iPS细胞 来源的造血干细胞与脐血造血干祖细胞向造血各系细胞分化,尤其是红系分化能力,并对相应的调控机制进行探讨,侧重研究Wnt3a、PGE2等分子的调控作用.通过全基因组表达及表观遗传学分析,比拟地中海贫血iPS细胞来源的造血干细胞与几种体内别离的造血干祖细胞,尤其是脐带血造血干祖细胞在编码及非 编码RNA基因表达,DNA甲基化及组蛋白乙酰化等方面的差异,并

8、用实时定量 PCR加以验证.根据实验得到的结果,选择 2030个目的基因进行干预,研究 候选基因对造血干细胞细胞增殖,多能性和分化潜能等功能的影响.比拟不同来源的问充质干细胞MSC作为滋养层细胞并辅以不同细胞因 子的混合培养体系对iPS诱导获得的HSC/HPC细胞体外扩增的作用,建立可以保 持HSC/HPC细胞多能性功能并显著提升干细胞数量的培养条件,以满足临床移 植应用的要求二、预期目标总体目标：由于遗传导致的B -地中海贫血是严重危害广东等地区的地方性疾病,目前尚无根治手段.本工程的总体目标是探讨利用病人来源的无DNA整合污染的iPS,通过基因修复联合血液分化的技术途径,探讨建立一套从B

9、-地中海贫血患者的 iPS诱导到突变基因原位修复,再到修复后造血干细胞分化的完整技术,为B -地 中海贫血患者的移植治疗提供大量自体来源的造血干细胞奠定根底.同时也明确iPS实际应用的可行性及平安性等指标, 本工程的完成不仅能够明确iPS及相关技 术用于B-地中海贫血治疗的可行性,也为其他一些遗传病的治疗起到重要的借鉴 作用.五年预期目标：1、建立包含有不同突变类型的地贫病人特异性的无外源 DNA整合的iPS库及 ES细胞库.约含各突变类型 加中海贫血iPS细胞株50100株.同时利用废弃的 体外受精的胚胎建立1020株地贫病人的ES细胞株及5株正常人的ESffi胞株用 于比照研究.2、建立非

10、整合 M中海贫血病人iPS细胞与地贫胚胎干细胞的基因组稳定性, 表观遗传和基因表达的数据库.明确iPS在组蛋白修饰,DNA甲基化等表观遗传 方面的稳定性.3、建立实用性的地贫突变基因修复的技术平台.明确经基因修复后的iPS在基因组,表观遗传等方面的稳定性及干性维持等特性.4、建立高效诱导iPS细胞分化为造血干细胞的培养条件及对分化的造血干细胞造血重建及移植功能的鉴定动物模型和相关技术;5、优化造血干细胞体外扩增的培养体系,筛选和鉴定可以用于对干细胞功能和平安性进行评价的分子标记物和指标；6、通过比照研究iPS诱导分化和脐带血来源的造血干细胞在基因表达及表观 遗传特征上的差异,揭示针对造血干细胞

11、增殖,分化及自我更新等生物学特性的 新的调控机制.7、优化非整合病人特异性iPS技术,将目前诱导效率提升100®左右,诱导 时间缩短到2周左右.建立非整合小鼠ESC羊白人iPS细胞技术.明确新型人iPS 细胞的多能性,基因组稳定性,平安性等指标.8、培养研究生30名,建立一支具有国际竞争力的,由优秀中青年科学家组 成的创新团队,培养一批能独立从事高水平科学研究的后备力量；9、在本领域的国际代表性学术SCI刊物上发表2僚篇学术论文,其中影响因 子高于5的不少于10篇,培养博士生15名,博士后5名.10、举办一次相关的国际性学术研讨会.三、研究方案技术路线:其整合人iPS技术的优其非整合

12、地贫PS库的建.明确地度iPS的基因维 衣观遢传稳定性, 国能性平安性等囚的修复L人彩胎干细胸系 浮立挂山 的华均宴株地宽E5细射系I的班订后因修复后地翻ipQh血液细胞的分ft,勘能比拟与评饰.平安指标确实立,及逆转小鼠地黄模型的病症5知测 J研究方案：1、探讨优化建立快速高效的获得iPS的技术1在mRNA诱导iPSC的根底上,通过筛选小分子化合物及蛋白,加速非病毒非整合iPSC的诱导；这一套系统我们已经在进行尝试.接下来筛选促进重编程的 microRNA ,建立传统的 iPSC EpiSC-Lik-iPSC .2利用 Dox-inducible 的载体Oct4、Sox2、Klf4、c-My

13、c 诱导体细胞 获得ESC-Lik-iPSC ;筛选能够维持自我更新的小分子,我们已经开始相关实验； 在此根底上,尝试建立非病毒非整合的 ESC-Lik-iPSC.可行性分析该局部研究内容的主要承当者赵小阳博士所在的实验室在以往的研究中, 开 展了大量的诱导iPSC的研究工作,利用病毒为载体高效诱导获得iPSC;并对iPSC 在分子水平上进行了充分的鉴定,以及完备的多能性检测.本实验需要开展的工 作中,mRNA的体外合成与纯化、microRNA的筛选工作我们已经开展,进展 良好.在我们之前的研究中,成功筛选出小分子化合物并改良了iPSC的诱导环境.对于本课题的各个环节,我们进行了细致的研究探讨

14、,认为我们根本掌握相 关技术,因此,我们有信心成功完成预期目标.创新性分析目前,国内外有多个实验室开展新的不依赖多能性因子的纯药物诱导方式, 试图提升iPSC的诱导效率；本课题的特色在于,从提升iPSC的诱导速度出发, 筛选新的小分子化合物及蛋白等各种因子,建立一个快速高效且简单易于操作的 iPSC诱导系统,降低iPSC表观遗传突变及基因组不稳定的风险,力争应用于将 来的临床实验中；新型的iPSC不仅在理论上有大的突破,还将为iPSC未来的临床应用提供基 础,这种iPSC将在大规模培养、基因修复、分化上拥有巨大的优势.与国内外 其他实验室相比,本研究更注重与实际应用联系起来,以推动iPSC最终

15、应用于临床治疗.2、建立非整合B -地中海贫血的病人特异性iPS库.本局部内容拟在该局部研究内容的主要承当者潘光锦博士以前的实验室建 立起来的episome的方法的根底上进行一定程度的修改用来获得地贫病人的 iPS.该技术将诱导因子克隆到含有EB病毒来源的复制元件的质粒上,该质粒主 要含有两种特殊元件,一是质粒复制子-oriP,另一是复制蛋白-EBNA .通常情况 下,普通质粒在进入细胞后如果不能整合到细胞的基因组中便不能进行自我复 制,很快就会被细胞内的酶降解.但是该系统的特点是当质粒导入细胞内后能够 表达复制蛋白EBNA,表达后的EBNA随后结合在复制子oriP上,使该质粒在染 色体外不经

16、过整合就可进行复制.这样就保证了由该系统携带的诱导蛋白在整个 iPS细胞诱导过程中得到表达.在获得iPS细胞后,导入的episome质粒由于不进 入整合到基因组,经过一定时间的体外培养便可逐渐失.最终通过筛选便可得到完全无外源DNA整合的地贫病人的iPS细胞.另外,除此之外,我们也会充分利 用研究内容1里面优化后的iPS技术建立非整合的病人iPSo可行性分析利用episome的方法建立人非整合iPS的技术首先由申请者潘光锦博士后的 实验室一Thomson实验室报道.潘博士回国后已经成功的建立了该系统,并在 诱导过程,培养基方面进行了优化,目前诱导效率不错见工作根底,在进一 步优化的根底上完全保

17、证本局部研究内容的可行.另外,本工程的申请单位之一南方医科大学南方医院及广西医科大学第一附属医院血液内科具有丰富的病人 来源,因此,本局部内容是完全可行的.创新性分析本项研究内容利用非整合技术建立包含有多种突变类型的多样性的B地贫的 iPS细胞库.为将来的进一步应用研究打下了根底,目前国内外尚无建立非整合 地贫iPS细胞的报道.3、优化和完善建立人胚胎干细胞的技术体系,并在此根底上建立地贫胚胎 干细胞库.本研究拟对现有的胚胎干细胞培养技术进行改良：利用不同发育阶段的IVF废弃的胚胎从桑根胚到孵出的晚期囊胚别离的人 ESC细胞进行均一性研究, 寻找最优化的细胞别离时间；通过对人源性的饲养层细胞及

18、无饲养层培养体系进 行优化,建立平安、稳定的人胚胎干细胞系技术平台.并在此根底上,建立不同 突变类型B地中海贫血人胚胎干细胞株50株以上.可行性分析该局部内容的承当团队海南省人类生殖与遗传重点实验室海南省生殖医学中央在2022年已经建立了稳定的海南人群的胚胎干细胞株,成为国内首批建立人胚胎干细胞的单位之一,并赠送给中科院上海细胞所、中科院广州生物医药 与健康研究院、郑州大学第一附属医院、西安交通大学医学院第一附属医院等多 个研究单位使用.在使用人源性的饲养层细胞及无饲养层培养体系方面积累了一 定的经验,发表干细胞相关SCI论文2篇；具有非常完善的地中海贫血基因诊断 体系、胚胎体外培养体系以及胚

19、胎干细胞别离体系.该中央目前每年新鲜IVF周期约2000例,具有丰富的地贫胚胎来源,因此能够保证这局部内容的顺利完成.创新性分析1目前人们已经建立数百个人类胚胎干细胞株,并且发现他们在分化水平 上有差异,究其原因,细胞异质性可能是其中之一.经典的人胚胎干细胞株是从 囊胚阶段的内细胞团别离建立的,本课题设计从不同发育阶段的胚胎从桑根胚 到孵出的晚期囊胚别离人ESC,并分析它们在表观遗传、基因转录及分化特性 上的差异.这一研究结果将为优化胚胎干细胞别离体系提供新的理论根底并为人 胚胎干细胞的生物学特性研究提供新的信息.2导致B地贫发病的B珠蛋白基因改变类型多样,在我国人群中,已发现的 B地贫突变类

20、型已到达40种以上.虽然国内已有局部单位建立了一些人疾病胚胎 干细胞株,但尚无中国南方人群各种B -地贫突变的系统的疾病胚胎干细胞库的报 道.本研究将首次建立较完整的B地贫突变疾病胚胎干细胞库, 为地贫发病机制、 地贫突变修复、iPS细胞造血分化等多项研究提供必须的疾病细胞模型.4、非整合B地中海贫血病人iPS细胞与地贫胚胎干细胞比拟性研究.比照研究地贫ES及iPS,建立其表观遗传和基因表达的数据库.利用基因芯 片及高通量DNA测序技术,比照检测地贫iPS与ESftSNP, DNA甲基化DNAmethylation),组蛋白修饰(Histone Modification) ,外显子序列(Exo

21、nSequencing等方面的差异.全面评价iPS在全能性,表观遗传学,基因组完整 性,相关功能性细胞分化的水平等,明确造血分化用 iPS的全能性,平安性等应 用标准.可行性分析人iPS生物平安性问题是iPS细胞用于临床治疗必须解决的问题,是当前干细 胞研究的一个重大方向.本团队结合自身的资源优势和特色, 建立中国南方地区 非整合B-地贫特异性iPS细胞及胚胎干细胞库,并利用这些模型开展比拟研究, 这些研究成果将为建立iPS的全能性,平安性等应用标准提供依据,同时也能够 把基因突变与个体化的疾病表型联系起来,为揭示B地贫的发生机制,寻求新的 治疗途径提供根底,在理论和技术上都是可行的.创新性分

22、析通过比拟不同突变类型及不同个体的新型B -地贫特异性iPS细胞及胚胎干细 胞株在向造血系等方向分化的过程中的表观遗传及基因转录水平等方面的差异, 将为研究地贫较宽的临床表现谱提供理论依据, 对地贫的发病机制具有重大的理 论创新意义；同时,这一比拟研究也将为明确iPS细胞治疗地贫的平安性标准提 供数据.5、iPS细胞功能性血液细胞分化及临床应用的血液细胞比照性研究.1采用不同造血组织来源人间充质细胞与人胚胎干细胞及 iPS细胞共培养诱 导造血分化,与目前较常用的EB形成及小鼠或其它组织来源的基质细胞共培养 体系进行诱导效率的比拟,筛选有效提升造血干细胞诱导效率的iPS细胞分化培养条件.2利用体

23、外细胞长周期培养、单细胞培养分化实验以及体内NOD/SCID鼠造血重建实验、骨髓竞争移植实验等,与脐带血HSC细胞比拟,评价多种来源的iPS分化来源的HSC/HPC体内定向归巢、造血重建等生物学功能.比拟iPS细 胞来源的造血干细胞与脐血造血干祖细胞向造血各系细胞分化,尤其是红系分化水平,并对相应的调控机制进行探讨,侧重研究 Wnt3a、PGE2等分子的调控作 用.3通过全基因组表达及表观遗传学分析, 比拟地中海贫血iPS细胞来源的造 血干细胞与几种体内别离的造血干祖细胞, 尤其是脐带血造血干祖细胞在编码及 非编码RNA基因表达,DNA甲基化及组蛋白乙酰化等方面的差异,并用实时定 量PC刖口以

24、验证.根据实验得到的结果,选择 20 -30个目的基因进行干预,研 究候选基因对造血干细胞细胞增殖,多能性和分化潜能等功能的影响.4比拟不同来源的问充质干细胞MSC作为滋养层细胞并辅以不同细胞 因子的混合培养体系对iPS诱导获得的HSC/HPC细胞体外扩增的作用,建立可以 保持HSC/HPC细胞多能性功能并显著提升干细胞数量的培养条件,以满足临床 移植应用的要求.5通过体外造血集落形成实验以及体内 NOD/SCID移植模型的建立,比拟 iPS细胞来源的造血干细胞与脐血造血干祖细胞向造血各系细胞分化,尤其是红 系分化水平,并对相应的调控机制进行探讨,侧重研究 Wnt3a、PGE2等分子的 调控作

25、用.可行性分析利用基质细胞共培养诱导多能干细胞的造血分化已是广泛应用的技术,目前已在课题申请单位中国医学科学院血液学研究所成功建立.工程申请单位拥有国内国际领先的间充质细胞库,为课题提出的研究内容提供了丰富的细胞资源. 问充质干细胞及其CM用于脐带造血干细胞的体外扩增体系及干细胞功能测定的动物模型也已在课题申请单位建立.同时申请单位对造血干细胞临床移植经验,为制定评价功能性和平安性的干细胞标准提供重要的技术保证.因此这局部的研究内容开展是可行的.创新性分析本项研究内容利用人造血组织来源的基质细胞及间充质干细胞诱导iPS细胞的造血分化,免除分化过程与动物来源的细胞接触的过程.这一培养体系均有创

26、新意义.问充质干细胞用于多能干细胞分化的造血干细胞的扩增尚未有报道对干 细胞的移植应用有重要意义,目前国内外间相关报道.课题设置课题问关系围绕工程所要解决的关键科学问题、主要研究内容和预期目标合理设谿课题.需说明课题设 谿的思路、各课题间的有机联系以及与工程预期目标的关系； 本工程围绕研究目标及拟解决的科学问题,设立了下述 4个有机联系的课题.其 中课题1主要是探讨和优化更具临床实用性的获得非整合病人特异性iPS勺技术,包括优化组合的诱导因子,诱导条件,摸索建立高效,实用,平安的获得病 人特异性的非整合iPSffl胞的技术体系.该课题完成好可以为课题2和3提供高效, 实用,平安的iPSK术以建

27、立多样性的iPSffi胞库.鉴于目前很多报道提到iPSM胞 在基因组稳定性,分化效率,移植后平安性等方面与正常的ESffi胞都存在着较大 的差异及具有应用的不确定性,课题2的研究内容主要是以同一标准在同一实验 室建立具有同一性的多株E极iPS进行相关比拟Tt研究,以明确iPSM胞有其是 地贫来源的iP亚稳定性,分化效率,移植后平安性等方面的指标,明确 iPS勺标 准.该课题与课题3充分合作,是整个工程的根底.课题3在参照课题1研究内容 的根底上,主要负责建立地贫病人来源的非整合 iPSffl胞库,利用基因打靶技术 修复地贫病人突变的基因并通过与课题 2合作明确经基因修复后的地贫iPS勺稳 定性

28、,分化效率,移植后平安性等方面的指标,是整个工程的核心局部.课题 4 研究如何高效率的分化iP效有功能的血液细胞,是整个工程的落脚点.课题1 :平安高效非整合iPS新技术的建立预期目标：1、优化非整合病人特异性iPSK术,将目前诱导效率提升100倍左右,诱导 时间缩短到2周左右.2、建立非整合小鼠ES醉白人iPSffl胞技术.3、明确新型人iPSM胞的多能性,基因组稳定性,平安性等指标. 主要研究内容：目前多数实验室常用的iPSK术是病毒介导的整合性诱导技术.非整合的iPS 技术如利用episomal载体等方法虽然可行,但效率较低,诱导过程较长,不利 于大规模的实用性.本课题拟在已有报道的根底

29、上,优化组合的诱导因子, 诱导条件,摸索建立高效,实用,平安的获得病人特异性的非整合iPSffi胞的技术体系.该课题完成好可以为课题2提供高效,实用,平安的iPSK术以建立多样 性的iPSffl胞库.1平安高效获得非病毒非整合iPSC勺新技术建立综合的诱导系统获得非病毒非整合的iPSC禾I用mRNAKmicroRN朋导体细胞获得iPSQ筛选能够加速iPSC 重编程的小分子化合物及蛋白；筛选高效的iPS明导培养液.在此根底上,建立综合的诱导系统获得非病毒非整合的iPSC2 iPSC勺鉴定：核型、基因表达、体外分化水平、体内多能性检测等多方面检测iPSO否符合干细胞的标准；分子水平才测外源基因的插

30、入；测序分析iPSC的基因组稳定性.3建立非病毒非整合小鼠ES抑的人类iPSCESC-like-iPSC筛选能够稳定 培养ESC-like-iPSC培养环境：通过传统的病毒诱导获得小鼠 ES卸的人类iPSCESC-like-iPSC;筛选小分子化合物稳定培养 ESC-like-iPSC筛选mRNAR microRNAi 持 ESC-like-iPS C 自我更新；4建立非病毒非整合ESC-like-iPSC开发诱导获得ESC-like-iPSC诱导系统；在全基因组表达、小RNAg达等方面比拟两种不同的iPSC勺差异.经费比例：20%承当单位：中国科学院动物研究所课题负责人：赵小阳课题2 : B

31、地中海贫血病人与正常人胚胎干细胞ES库建立及相关比拟性研究预期目标：1、建立包含有不同突变类型的地贫病人 ESffl胞库.同时利用废弃的体外受 精的胚胎建立10-20株地贫病人的ESffl胞株用于比照研究.2、建立非整合 加中海贫血病人iPSM胞与地贫胚胎干细胞的基因组稳定性, 表观遗传和基因表达的数据库.明确iPSft组蛋白修饰,DNA甲基化等表观遗传方 面的稳定性.主要研究内容:目前很多报道提到iPSM胞在基因组稳定性,分化效率,移植后平安性等方 面与正常的ESM胞都存在着较大的差异.因此,有必要在同一实验室建立具有同 一性的多株ESf iPS!行相关比拟性研究,以明确iPSffi胞有其是

32、地贫来源的iPSfc 稳定性,分化效率,移植后平安性等方面的指标,明确iPS勺标准.该课题与课题3充分合作,是整个工程的根底.利用体外受精胚胎建立多株正常人及地贫病人的ESM胞系.又t比地贫iPSSES,评价iP够能性,平安性等应用指标.1)优化和完善建立人胚胎干细胞的技术体系,并在此根底上建立地贫胚胎 干细胞库及正常人的ESffl胞系：本研究拟对现有的胚胎干细胞培养技术进行改 进：利用不同发育阶段的IVRg弃的胚胎(从桑根胚到孵出的晚期囊胚)别离的 人ESC田胞进行均一性研究,寻找最优化的细胞别离时间；通过对人源性的饲养 层细胞及无饲养层培养体系进行优化,建立平安、稳定的人胚胎干细胞系技术平

33、 台.并在此根底上,建立不同突变类型 地中海贫血人胚胎干细胞株50株以上.2)非整合 加中海贫血病人iPS细胞与地贫胚胎干细胞比拟性研究. 比照研究 地贫ES及iPS,建立其表观遗传和基因表达的数据库.利用基因芯片及高通量 DNA测序技术,比照检测地贫iPS与ESftSNP, DNA 甲基化(DNA methylation),组蛋白修饰(Histone Modification) ,外显子序列(Exon Sequencing)等方面的差异.全面评价iPS在全能性,表观遗传学,基因组完整 性,相关功能性细胞分化的水平等,明确造血分化用 iPS的全能性,平安性等应 用标准.经费比例：17%承当单位

34、： 南方医科大学南方医院、海南医学院课题负责人：余艳红课题3 :非整合B地中海贫血病人iPS细胞库建立,突变基因修复及其平安性评价预期目标：1、建立包含有不同突变类型的地贫病人特异性的无外源DN整合的iPS库.约含各突变类型 地中海贫血iPS细胞株100株.2、建立实用性的地贫突变基因修复的技术平台.明确经基因修复后的iPS在基因组,表观遗传等方面的稳定性及干性维持等特性.主要研究内容：由于本工程是探讨iPS治疗前景的研究,所以首先得建立平安,无整合的地贫病人的iPS细胞库.通过与课题2合作,比拟获得的地贫ESM胞,明确iPS的标 准.由于地贫iPS本身带有突变,所以必须利用有效的方法将这些突

35、变修复,并于课题4合作,探讨修复后iPS功能性血液细胞分化的技术途径及可行性.1建立非整合 加中海贫血病人iPS细胞库,约含各突变类型 融中海贫血iPS 细胞株200株.2利用基因重组技术修复地贫病人的突变基因,建立实用性人多能细胞中 进行基因修复的平台.3基因修复后iPS基因组及表观遗传学稳定性的研究. 通过基因芯片的技术 手段检测基因修复后iPS的SNP CNVM弋表基因组稳定性的指标.并进行外显子 测序Exon Sequencing来确定有无重要基因发生突变等.利用 CHI图合高通量 测序技术确定经体外基因修复后的iPS在组蛋白修饰,DN用基化等表观遗传方面 的稳定性.4基因修复后iPS

36、多能性的维持.研究经体外基因操作后,iPS维持其多向分化潜能的水平.通过非定向的分化手段如裸鼠体内畸胎瘤的形成,体外类胚胎EB的形成等手段比照基因修复前后地贫iPS的分化潜能.并通过定向分化的方式如,神经分化,血液分化等比照探讨iPS在基因修复过程中的多能性维持. 经费比例：39%承当单位：中国科学院广州生物医药与健康研究院课题负责人：潘光锦课题4 : iPS功能性血液分化的研究及基于动物模型的功能评价 预期目标：1、建立高效诱导iPS细胞分化为造血干细胞的培养条件及对分化的造血干细 胞造血重建及移植功能的鉴定动物模型和相关技术；2、优化造血干细胞体外扩增的培养体系,筛选和鉴定可以用于对干细胞

37、功能和平安性进行评价的分子标记物和指标；3、通过比照研究iPS诱导分化和脐带血来源的造血干细胞在基因表达及表观 遗传特征上的差异,揭示针对造血干细胞增殖,分化及自我更新等生物学特性的 新的调控机制.主要研究内容：是否能够高效的获得有功能的血液细胞是iPS细胞最终能够应用的关键.本 课题将于课题3合作建立实用性的iPS细胞血液分化的技术平台及相关功能评 价.1采用不同造血组织来源人间充质细胞与人胚胎干细胞及 iPS细胞共培养诱 导造血分化,与目前较常用的E卵成及小鼠或其它组织来源的基质细胞共培养体系进行诱导效率的比拟,筛选有效提升造血干细胞诱导效率的iPS细胞分化培养条件.2利用体外细胞长周期培

38、养、单细胞培养分化实验以及体内 NOD/SCI瞅造 血重建实验、骨髓竞争移植实验等, 与脐带血HSC田胞比拟,评价多种来源的iPS 分化来源的HSC/HP体内定向归巢、造血重建等生物学功能.比拟iPS细胞来源的 造血干细胞与脐血造血干祖细胞向造血各系细胞分化, 尤其是红系分化水平,并 对相应的调控机制进行探讨,侧重研究 TGF-beta、Wnt3a PGE等分子的调控作 用.3通过全基因组表达及表观遗传特征分析,比拟地中海贫血iPS细胞来源的造血干细胞与几种体内别离的造血干、 祖细胞,尤其是脐带血造血干、祖细胞在 编码及非编码RN照因表达,DN用基化及组蛋白乙酰化等方面的差异, 并用实时 定量

39、PC协口以验证.根据实验得到的结果,选择 20-30个目的基因进行干预,研 究候选基因对造血干细胞细胞增殖,多能性和分化潜能等功能的影响.4比拟不同来源的问充质干细胞 MSC作为滋养层细胞并辅以不同细胞因 子的混合培养体系对iPS诱导获得的HSC/HPC胞体外扩增的作用,建立可以保持 HSC/HPC胞多能性功能并显著提升干细胞数量的培养条件,以满足临床移植应 用的要求.经费比例：24%承当单位： 中国医学科学院血液病医院血液学研究所、山东大学 课题负责人：邱录贵四、年度方案研究内容预期目标第一年1 .体外合成多个多能性因子的 mRN A2 .筛选促进体细胞重编程的小 分子化合物及蛋白；3 .m

40、iRNA诱导获得非整合人类 iPSC;4 .利用dox-inducible 系统建 立新型的人类iPSC(ESC-Like- iPSC).5 .利用/、同发育阶段的IVF废 弃胚胎(从桑根胚到孵出的晚期囊 胚)别离人ES细胞,并进行均一性 研究,寻找最优化的ES细胞别离时 问；6 .对无词养层人ES培养体系进 行优化；7 .利用废弁的体外受精的胚 胎,建立不同突变类型 B地中海贫 血人胚胎干细胞株.8 .初步建立非整合B地中海贫 血病人iPS细胞库；9 .尝试利用锌指蛋白介导的同 源重组技术对获得的地贫病人iPS中B珠蛋白的突艾基因进行修复.10 .建立包括胚肝,骨髓,脐带1 .建立体外合成m

41、RNA勺系统；2 .建立miRNAW导iPSC的系统；3 .建立新型的人类iPSC (ESC-Like-iPSC);4 .优化和完善建立人胚胎干细 胞的技术体系；5 .建立2-5株正常人ES细胞株 及2-5株地贫病人的ES细胞株.6 .建立非整合B地中海贫血病 人iPS细胞株2550株;7 .建立利用锌指蛋白介导的同 源重组技术进行基因修复的技术平 台；8 .明确/、同人间充质细胞对胚 胎干细胞及iPS细胞造血分化支持 功能；9 .明确/、同造血分化体系,如 EB形成、鼠源细胞共培养的造血分 化支持功能优劣性；10 .初步筛选针对不同多能干细 胞,胚胎干细胞vs iPS细胞,正常 iPS vs

42、地贫iPS,的最优造血分化培 养条件.研究内容预期目标等多种组织来源的人间充质细胞库；11 .将人胚胎干细胞及正常或地 贫来源的iPS细胞与上述/、同来源 的问充质细胞共培养诱导造血分化；12 .比拟人胚胎干细胞或iPS细 胞利用EB形成及小鼠来源的基质细 胞共培养体系造血分化的诱导效率.第二年l.mRNA诱导获得非整合的人类 传统的 iPSC (EpiSC-Like-iPSC );2 .检测mRNAf miRNAW导获得 的iPSC是否存在某些差异；3 .筛选能够促进iPSC的miRNA4 .筛选促进新型iPSC自我更新 的小分子药物；5 .利用高逋量DNAW序技术,对 新型非整合B地中海贫

43、血病人iPS 细胞进行测序；6 .在优化的人胚胎干细胞技术 体系根底上,建立不同突变类型B地中海贫血人胚胎干细胞株.7 .优化非整合的iPS技术,建立 非整合的病人iPS；8 .继续扩增非整合B地中海贫 血病人iPS细胞库的库存量；9 .利用锌指蛋白对获得的地贫 病人iPS中B珠蛋白的突变基因进 行修复；10 .利用体外造血集落形成实1 .建立mRNAS效诱导非整合 iPSC的体系；2 .筛选出1-2个能够促进iPSC 产生的小分子化合物或诱导条件；3 .初步建立地贫病人的ES细胞 库；4 .建立地贫iPS基因组数据库.5 .利用废弁的体外受精的胚胎 建立10-15株地贫病人的ES细胞株；6

44、.再建立非整合B地中海贫血 病人iPS细胞株2550株,使B地 中海贫血病人iPS细胞库的库存量 到达含各突变类型 B地中海贫血 iPS细胞株100株;7 .明确/、同来源的造血干祖细 胞在体外造血分化水平上的差异,为 进一步体内功能实验设计提供实验参;8 .明确/、同来源的造血干祖细 胞在编码及非编码基因组表达,DNA 甲基化及组蛋白乙酰化等方面的差研究内容预期目标验、体外红细胞定向分化培养,分析 /、同诱导分化途径的iPS细胞来源 的造血干细胞与脐血造血干祖细胞 向造血各系细胞分化,尤其是红系分 化水平；11.利用基因芯片技术并结合 CHIP-on-Chip手段,分析地中海贫 血iPS细胞

45、来源的造血干细胞与几 种体内别离的造血干祖细胞,尤其是 脐带血造血干祖细胞,在基因组表达 及多种表观遗传学特征上的差异.异,选择40 50个目的基因采用实 时定量PCR&口以验证,为后期功能实 验提供根据.第三年1 .结合miRNAf mRNA勺诱导方 法,建立一个高效诱导非整合的 iPSC的诱导体系；2 .检测体细胞重编程时间对 iPSC的影响；3 .利用小分子化合物、新型多能 性因子,结合mRN闲miRN顺导获 得非整合的新型的iPSC;4 .筛选新的多能性因子；5 .禾IJMWS# DNAM序 对B地中海贫血病人ESffl胞进行测 序；6 .比照新型非整合B地中海贫 血病人iPS

46、与ES细胞在基因组稳定 性方面的差异.7 .利用锌指蛋白对获得的地贫 病人iPS中B珠蛋白的突变基因进1 .发现1-2个新的miRN也高 iPSC的诱导效率；2 .揭示/、同诱导方法对iPSC的 质量的影响；3 .初步建立B地中海贫血病人 ES细胞的基因组数据库；4 .明确新型非整合B地中海贫 血病人iPS的基因组稳定性；5 .获得基因修复后iPS的SNP CNVIM弋表基因组稳定性的指标,确 定后无重要基因发生突艾,确定基因 修复后的iPS在组蛋白修饰,DNAP 基化等表观遗传方面的稳定性；6 .获取决定iPS分化来源的 HSC/HPC：内定向归巢、造血重建等 生物学功能的多种影响因素,进一步 优化iPS造血干细胞定向分化的培研究内容预期目标行修复.8 .基因修复后iPS基因组及表 观遗传学稳定性的研究.9 .利用体外细胞长周期培养、单 细胞培养分化实验等,与脐带血HSCM胞比拟,评价多种来源的iPS 分化来源的HSC/HPC：内定向归巢、 造血重建等生物学功能；10 .在上述基因芯片及定量 PCR 分析结果的根底上,选择20- 30个 可能与造血干细胞功能肩关的目的 基因,如 Wnt