肠道致病菌的分离与鉴定

1、肠道致病菌得分离与鉴定一、实验目得（1）掌握肠道致病菌得分离、鉴定得主要步骤（2）掌握平板划线分离法（3）掌握玻片凝集试验得操作方法以及实际意义二、实验材料（1）实验仪器：试管、玻片、酒精灯、接种针、接种环、试管架、（2）实验试剂：生理盐水、细菌培养基、伤寒诊断血清、伊红美蓝 培养基（EMB、克氏双糖铁培养基（KIA）、葡萄糖发酵管、乳糖发酵 管、甘露醇发酵管、尿素培养基、蛋白胨水、半固体培养基三、实验流程（ 1、肠道致病菌得分离 待测标本得制作：把接种环放置于点燃得酒精灯火焰处对其进 行灭菌，用已灭菌得接种环在细菌培养基中取少量待测细菌于盛有 5ml 生理盐水得试管中，混匀。 细菌得分离接种

2、：用接种环取适量配置好得细菌悬液，在酒精灯附近进行划线分离法接种细菌于 EMB培养基。将培养基置于37C 培养 1824 小时。（ 2 、肠道致病菌得纯化 单菌落接种：从已培养待测细菌得 EMB 培养基上用已灭菌得接 种针挑取某单个菌落接种到 KIA 培养基上，一部分直接深入培养基中 底部，一部分直接涂抹于斜面处，置于 37 C培养1824小时。 待测细菌得初步判断： 取出已纯化培养待测细菌得 KIA 培养基， 观察现象，初步断定该细菌就是致病菌或就是非致病菌。（3）肠道致病菌得鉴定 生化鉴定：分别取葡萄糖、乳糖、甘露醇发酵管各一只（注意 管内得小倒管则应充满液体，不含气泡） ，用已灭菌得接种

3、针取已培 养得KIA培养基上得培养物接种于各发酵管，将各发酵管于37 C培养 1824 小时。取出并观察记录现象。 （注意每次使用接种针前都应 用酒精灯火焰进行灭菌） 动力检查：用已灭菌得接种针取 KIA 培养基上得培养物分别接 种于蛋白胨水、尿素培养基、半固体培养基中，将各个培养基于37 C 培养 1824 小时。取出后将靛基质（吲哚）加入到蛋白胨水培养基 中，并观察记录现象。 （注意每次使用接种针前都应用酒精灯火焰进 行灭菌） 血清学鉴定：取洁净玻片一张，将其用蜡笔分为两格，两边各 取生理盐水一滴，再用已灭菌得接种环分别取 KIA培养基上得培养物 加入两格中，与生理盐水混匀不摊开。 （注意

4、每次使用接种环前都应 用酒精灯火焰进行灭菌） 然后在第二格中滴入一滴伤寒诊断血清， 混 匀不摊开，轻轻摇动玻片，经 12min 观察两格中有无凝集现象。 注：本实验涉及细菌接种都应在无菌条件下进行，由于条件有限，因 而可在燃烧得酒精灯附近进行实验操作。四、实验结果与分析（ 1）EMB 培养基现象与分析： 培养基下部呈现黑色现象，上部培养基仍为红色，培养基斜面 有细菌明显蔓延生长。 分析：培养基下部出现黑色现象，说明该细菌能够分解培养基 中得物质并产出硫化氢气体， 由于培养基中含铁， 因而硫化氢能够与 其结合成硫化铁，出现黑色现象；而上部因重力含铁量较少，产生得 硫化氢气体又部分挥发， 只有少部

5、分能够与少量铁结合， 故产生得现 象不明显，上部仍呈现红色。（2）生化鉴定现象与分析： 葡萄糖发酵管：管内培养基指示剂由紫色变成黄色，其内可见 细菌有明显生长现象，无气泡产生。 分析：培养基指示剂由紫色变成黄色， 说明该细菌能够分解葡萄糖并 产酸但不产气，使得指示剂内化学物质发生颜色改变。 乳糖发酵管：管内培养基指示剂颜色不发生改变，仍为紫色， 有明显细菌生长现象，无气泡产生。 分析：培养基指示剂不发生颜色改变， 说明该细菌能分解乳糖但不能 产酸也不产气，使得管内指示剂无明显现象。 甘露醇发酵管：管内培养基指示剂由紫色变成黄色，其内可见 细菌有明显生长现象，无气泡产生。 分析：培养基指示剂由紫

6、色变成黄色， 说明该细菌能够分解甘露醇并 产酸但不产气，使得指示剂内化学物质发生颜色改变。（3）动力检查现象与分析： 尿素培养基：管内培养基指示剂颜色无明显变化，但有明显气 泡产生，有明显细菌生长现象。 分析：管内培养基指示剂无明显颜色改变， 说明该细菌不能分解尿素， 但培养基中其她物质成分可以使细菌分解产气，因而产生气泡。 蛋白胨水：管内指示剂颜色无明显变化，有明显细菌生长现象， 无气泡产生。加入靛基质（吲哚）试剂后不出现玫瑰红色。 分析：加入靛基质指示剂后不呈现玫瑰红色， 说明该细菌不能分解培 养基中得色氨酸产生靛基质，因而靛基质指示剂不能与之发生化学反 应，出现颜色变化。 半固体培养基：

7、管内指示剂颜色无明显变化，有明显细菌沿穿 刺线扩散生长现象，无气泡产生。分析：细菌能够沿穿刺线生长，说明该细菌有鞭毛，能运动，有助于 鉴别细菌种类。（4）血清学鉴定现象与分析： 现象：通过玻片两边对比，在加有伤寒杆菌诊断血清得第二个 格子中周围液体清澈，有明显凝集现象；另一格液体表面浑浊，无凝 集现象。 分析：第二格中加入伤寒杆菌诊断血清出现凝集现象，说明接种细菌应为伤寒杆菌，二者特异性结合产生抗原抗体复合物， 因而呈 现凝集现象；而第一格中未加入伤寒杆菌诊断血清， 接种细菌无相应 抗体，不能产生抗原抗体复合物，所以不呈现凝集现象。综上：葡萄糖甘露醇乳糖靛基质硫化氢尿素分解动力现象+一一+ + +一+由此判断：该细菌应为乙型副伤寒杆菌。五、实验总结本次实验所需材料较多，实验流程较复杂，需要动手操作得步骤 较频繁，因而在实验过程中需要多加注意操作方法。在实验进行前应熟悉掌握实验得操作步骤及流程，了解实验 操作得方法，以便实验得顺利进行。实验应在无菌操作下进行，如可在燃烧得酒精灯附近进行细菌接种（注意酒精灯安全， 切勿灼烧自己或就是实验仪器，防止事故 得发生）。 细菌得培养应在适宜得环境下进行，避免外界环境影响细菌 得生长繁殖（由于实验室已配备培养箱，故出