液氮低温保留对大鼠主动脉光滑肌细胞和成纤维细胞MHC抗原无影响

1、液氮低温保留对大鼠主动脉光滑肌细胞和成纤维细胞MHC抗原无影响【关键词】，保留关键词：保留，生物学;抗原性;移植，同种;主动脉;主要组织相容性抗原I类摘要:目的探讨液氮低温保留对同种异体主动脉移植物抗原性的影响.方式采用细胞培育技术和流式细胞仪技术研究液氮低温保留对大鼠主动脉光滑肌细胞和成纤维细胞主要组织相容性抗原I类（MHCI类抗原）表达的影响.成立大鼠同种异体主动脉移植模型，采用免疫组织化学实验研究新鲜主动脉和低温保留的主动脉同种异体移植后MHCI类抗原和MHCII类抗原表达的区别.结果正常培育的大鼠主动脉光滑肌细和成纤维细胞MHCI类抗原表达的阳性率别离为（士）%和（±）%；液

2、氮低温保留的大鼠主动脉光滑肌和成纤维细胞在苏醒后MHCI类抗原表达的阳性率别离为（士）%和（±）%.统计学分析表明大鼠主动脉光滑肌细胞和成纤维细胞的MHCI类抗原表达在液氮低温保留前后无显著性不同.免疫组织化学实验研究表明新鲜主动脉和低温保留的主动脉同种异体移植后MHCI类抗原和MHCII类抗原表达无显著的不同.结论液氮低温保留对大鼠主动脉光滑肌细胞和成纤维细胞MHC类的抗原性没有明显的影响.Kcwords:prescrration,biological;antigcnicity;transplan-tation,homologous;aortic;histocompatibilit

3、yantigensclussIAbstract:AIMToinvestigatetheeffectoffluidnitrogencryoprcscnationontheMHCantigenicityofaortichomo-Bymeansofcellcultureandflowcy-tometrywestudiedtheeffectoffluidnitrogencryoprcscr-vationontheexpressionofMHCIantigenofsmoothmus-clccellsandfibroblastsofaortichomograftsoftheestablishmentofa

4、nimalmodelsofaortichomografttrans-plantation?usingimmunohistochemicalstaining,thediffcr-cnceoftheexpressionofMHCIantigenandMHCUanti-genwasdetectedbutwuunfreshaortichomograftsandcryop-rcsurvudaorticExpressionrateofMHCIantigunofculturedsmoothmusclecellsandfibroblastwas(±)%,(±)%rcspcctivcly；a

5、ndthatoftherevivedsmoothmusclecellsandfibroblastsofaortichomograftsaftercryopreservationwas(±)%,(±)%,therewasneithersignificantdifferenceofMHCIantigenexpressionofsmoothmusclecellsandfibroblastofaortichomograftsbetweenbeforeandafternitrogenfluidcrycprustrvation(P>,P>),nordiffe

6、renceoftheexpressionofMHCIantigenandMHCIIantigenbetweenfreshaortichomograftsandcrycprusurvudaorticFluidnitrogenetyopresenationhasnoobviouseffectontheMHCantigciiiacityofaortichomograftsofrats.0引言同种异体主动脉是心血管外科常常利用的修补和替代材料，其移植后的免疫排斥反映是影响移植远期效果的重用因素1.液氮低温保留是同种异体主动脉移植物比较成熟的保留方式，在临床上已被普遍地采用.液氮低温保留方式对同种异体主

7、动脉的抗原性影响是同种异体主动脉移植进程中超级重要的问题，同时也是一个有争议的问题2-4,在国内外都未见定量研究.咱们采用细胞培育方式和流式细胞仪技术，在细胞水平定量研究低温（-196）对大鼠的主动脉光滑肌和成纤维细胞抗原性的影响.1材料和方式实验1：液氮低温保留对培育光滑肌和成纤维细胞MHC抗原的影响材料SD大鼠，雌雄不限，体质量15（）180g,由本校实验动物中心提供.小牛血清（FCS）（浙江四季青生物制品研究所）；RPM11640培育基（Gibco公司）；胶原酶（Sigma公司）;胰蛋白酶（Sigma公司）;消化液：12gL-1胰蛋白酶10mL,2gL-lED-TANa210mL,生理盐

8、水80mL分装，-2（）保留;小鼠抗大鼠MHCI类抗原mAb（mousc-juiti-ratMHCIantigenmAb）（本校免疫教研室提供）利用浓度:PBS（,L-1）50倍稀释;羊抗小鼠IgG荧光抗体（goatantimouseIgGFlTC）（北京军事医学科学院邦定公司）利用浓度:PBS（,L-1）10倍稀释;流式细胞仪（美国Coulter公司）.实验分组:A.正常培育的光滑肌细胞组；B.经液氮低温保留的光滑肌细胞组（4wk）;C.正常培育的成纤维细胞组;D.经液氮低温保留的成纤维细胞组（4wk）.方式取150180g（810周龄）的SD雄性大鼠，用乌拉坦（800mgkg-1）ip麻醉

9、,无菌条件下掏出主动脉,按Chamlcy-Campbcll5的贴壁方式培育光滑肌细胞和成纤维细胞.细胞生长致密时，以L-1胰蛋白酶及L-1EDTANQ消化液消化传代.实验采用第3代传代细胞用20gLi胶原酶和L-1胰蛋白酶消化细胞,PBS（,L-1）洗涤2次（冻存的细胞苏醒后用培育液将DMSO置换出，再经PBS洗涤），调整细胞密度为109L-1.取5（皿细胞悬液加小鼠抗大鼠MHCI类抗原mAb5（hL（工作浓度），4条件下维持60min,无关抗体对照组加羊抗兔IgGmAb.洗涤液洗涤2次后加工作浓度的羊抗鼠IgG荧光抗体,充分振摇,4维持30min.洗涤液2mL洗涤2次,1000rmin-1离

10、心5min,加固定液1mL上流式细胞仪测定.实验2:液氮低温保留对移植同种异体主动脉MHC抗原的影响材料上海雄性SD大鼠100只，供体50只，体质量180230g,受体50只，体质量250300g（本校动物实验中心）.显微外科手术器械包（上海手术器械厂），11-（）显微外科缝线（杭州富阳医用缝合线厂）.第1抗体:小鼠抗大鼠MHCI类抗原mAb,利用浓度1100（北京邦定公司），小鼠抗大鼠MHCII类抗原mAb,利用浓度15（）（北京邦定公司）,第2抗体洋抗小鼠IgGABC试剂盒,利用浓度1200（Vec-tor公司）.动物分组:A组，新鲜同种主动脉移植组，B组:低温（-196）保留的同种主动脉

11、移植组.方式供体大鼠麻醉后开胸，在14倍手术显微镜下分离出主动脉带瓣管道，去除外膜并结扎左右冠状动脉，4生理盐水清洗后，用Kirklin和Barrct-Boyus方式进行低温保留5-7.同种异体主动脉移植的动物模型采用同种带瓣主动脉异位植入腹主动脉的方式1,8.受体SD大鼠用乌拉坦（800mgkg-l）ip麻醉后在无菌条件下纵切腹部，于14倍手术显微镜下分离腹主动脉，在肾动脉分支以下和左右股动脉分支点以上肯定移植位点.移植位点近端与远端用血管夹阻断血流，切断腹主动脉，以端对端的吻合方式将带瓣主动脉植入受体大鼠的腹主动脉，吻合线为显微外科缝线，以中断缝合方式吻合.腹主动脉血流阻断时间一般为304

12、0min.假移植手术组的大鼠将腹主动脉切断后直接吻合.每组别离于术后3,7,14,21和28d取材，每组每次处死动物为5只，移植受体大鼠颈动脉放血后，剪开腹腔，在14倍手术显微镜下分离掏出移植物.掏出的移植物经生理盐水冲洗后，置于40mLL-l多聚甲醛固定624h,常规脱水，石蜡包埋,制成5km石蜡切片，待免疫组织化学染色.阴性对照染色抗体为鼠抗人血型抗原AmAb（华丽生物工程公司）；阳性对照采用同种异体主动脉移植4wk后的标本.ABC法染色9:小鼠抗大鼠MHCI类抗原和MHCII类抗原mAb（第1抗体）稀释至1100（）,生物素化羊抗小鼠IgG抗体（第2抗体）稀释至1200,avidin标记

13、的ABC复合体稀释至1200.第1抗体在37反映60min,再加入生物素化第2抗体37下反映30min,然后加入avidin标记的HRP复合体反映60min,标本最后加DAB-H2Q2液显色，复染，室温下自然干燥，脱水，透明，封片后光学显微镜下观察.按照染色（阳性为棕褐色）的程度和范围积分（。5）10:0分，阴性;1分，极弱阳性;2分，弱阳性;3分,中度阳性;4分,强阳性;5分,极强阳性.统计学处置:所有数据均以x±s表示，以组间t查验进行统计学分析.2结果培育的光滑肌细胞与冻存苏醒后的光滑肌细胞MHCI类抗原表达无显著不同（Tabi）.正常培育的成纤维细胞与冻存苏醒后的成纤维细胞M

14、HCI类抗原表达无显著不同（Tabi）.阳性对照标本MHCI和MHC1I染色均为强阳性()；阴性抗体对照染色均为(-).A组与B组MHCI类抗原分子表达染色积分无显著不同(Tab2),A组与B组MHC1I类抗原分子表达染色积分无显著不同(Tab3).表1光滑肌细胞和成纤维细胞MHCI类抗原的表达略表2移植物MHCI类抗原分子表达染色积分略表3移植物MHCII类抗原分子表达染色积分略3讨论目前液氮低温保留方式是同种异体主动脉和肺动脉移植物比较成熟的保留方式，但液氮低温保留方式对移植物抗原性的影响是同种异体主动脉和肺动脉移植进程中相当重要的问题.在此问题上存在两种观点:液氮低温保留方式可以降低同种

15、异体主动脉移植物的抗原性;液氮低温保留方式对同种异体主动脉移植物的抗原性没有影响.Fontan等2以为长期低温保留可降低同种异体主动脉移植物的抗原性，Shumway3也以为只有新鲜的同种异体主动脉移植物才能激发宿主的免疫反映Khatib等4在非近交系大鼠的同种异体主动脉移植中发现液氮低温保留方式并非能使同种异体主动脉移植物对宿主的抗移植物的免疫排斥反映的致敏作用减弱Cochran等H在移植物的皮下包埋实验中也证明了液氮低温保留方式并非能降低移植物的抗原性.羊的同种异体主动脉移植实验表明液氮低温保留的移植物在移植后淋巴细胞浸润多于4营养液保留的移植物，这说明液氮低温保留方式保留了血管组织的抗原性

16、，并引发宿主动物的免疫排斥反映12.Salomon等13和Yankah等14也在实验中证明液氮低温保留的主动脉光滑肌细胞和内皮细胞能表达MHCI类和II类抗原，但没有与正常主动脉光滑肌细胞和内皮细胞进行定量的对比研究.总之，大多数作者以为液氮低温保留不能改变移植物的抗原性，但都没有精准定量的分析和研究结果.咱们采用流式细胞仪技术，对培育的主动脉光滑肌细胞和成纤维细胞的MHCI类抗原分子的表达进行定量研究，发现液氮低温保留对光滑肌和成纤维细胞的MHCI类抗原分子的表达没有明显的影响，光滑肌细胞冻存前MHCI类抗原表达率为（土）,冻存苏醒后的表达率为（土）,两组之间没有显著不同，成纤维细胞冻存前M

17、HCI类抗原表达率为,冻存苏醒后表达率为（士）,两组之间没有显著不同.实验中咱们还发现主动脉的光滑肌细胞与成纤维细胞的MHCI类抗原分子表达在冻存前后都没有明显不同.对同种异体主动脉移植后移植物的免疫组织化学实验也证明新鲜主动脉（A组）与低温保留的主动脉（B组）移植物MHCI类和II类抗原分子的表达没有显著不同，这说明液氮低温保留对移植物的抗原性没有影响.这些都证明了液氮低温保留没有影响移植物的抗原性.总之，液氮低温保留方式不能改变移植物的抗原性，这对同种异体主动脉和肺动脉移植是不利的因素，可见液氮低温保留移植物有明显的长处，同时也有致命的弱点.如何能在保留移植物组织生物活性的同时降低移植物组

18、织的抗原性有待于进一步的研究.参考文献：11LupincttiFM,CobbS,KioschosHC,ThompsonSA,WaltersKA,Mooreofimmtuiologicaldifferencesonrataor-ticvalveallograftcalcificationJJCardSurg,1992;7(1):65-70.2_FontanF,ChoussatA)DevilleC)DoutrcmcpuichC,Coupil-kindJcoupillandJ,VosaC,Pessacvalvehomograftinthesurgicaltreatmentofcomplexcardi

19、acmalformationsJJThoracCardiovascSurg,1984；87:649-657.3 ShumwayviabilityinvalvegraftJ.AnnThoracSurg,1989；47(3)：795-796.4 KhatibHE,Lupincttioffreshandcrycpru-survcdratvalveallograftsJ.Transplantation,1990;49(4):765-767.5 ArmigerLC,Gavinassessementoforthotopicaorticvalveleafletallografts:Itsroleinsele

20、ctinggraftpre-treatmentJ.Pathology,19835(1):67-71.6 McGrathLB?Gonzclcz-Lavin,Grafhomograftimpkintationforventricularoutflowtractreconstructin:EarlyphaseresultsJ.AnnThoracSurg,1988;45(1):273-277.7 ()'BrienMF,JohnstonstudyofthecellsinthecxplantcdviablecrycprcscrvudallograftvalveJJCardSurg,1988;3(S

21、uppl):279-287.8 MulliganMS,TsaiTT,KneeboneJM,WardPA,ofpresentationtechniquesoninvivoexpressionofadhe-sionmoleculesbyaorticvalveallograftsJ.JThoracCardio-vascSurg,1994;107(3):717-723.9 LiuM.BcijingrRcnmingWeishengChubanshc,1990:94-95.10 LemstromKB,Bruningdrugimmunosuppressionsignificantlyreducesimmneactivationandallograftartcrioscle-rosisincytomegalovirus-i