VP22融合型显性负性突变体抑制乙肝病毒复制

1、VP22融合型显性负性突变体抑制乙肝病毒复制作者：易军，宫卫东，王岭，凌瑞，陈江浩，王辉，王廷【关键词】肝炎病毒Inhibitionof hepatitisB virus replicationby dominant negativemuta nt of VP22 fusi on p rotein【Abstract 】AIM: To investigate the inhibitory effect on hepatitisB virus (HBV) re plicati on with domi nant negative (DN) muta nt of VP 22 fusio n p ro

2、te in. METHODS: Fullle ngth or fractio ns of VP 22 were fused to C terminal of HBVsore protein (HBc), and cloned into (-) vector, yielding eukaryotic exp ressi on p lasmids of DN muta nt. After tran sfectio n into cells, the exp ressi on of DN muta nt was ide ntified by immuno fluoresce nee stai nin

3、g. The in hibitory effect of DN muta nt on HBV rep licati on was in dexed as the concen trati on of HBV surface an tige n (HBsAg) in the supern ata nt of cell culture. And MTT assay was p erformed to detect the cytotoxicity of transgene expression to the host cells.RESULTSDNmutantof VP22 and its fra

4、ctions could be exp ressed in cells, and had no toxic effect on the host cells. The DN muta nt could in hibit HBV rep licati on, and the mutant with protein transduction ability had a stronger inhibition than that without. The DN muta nt of fullle ngth VP 22 had the strongest inhibitory effect,reduc

5、ing the HBsAgconcentrationby %.CONCLUSION: DN mutant of VP22fusion protein can enhance the inhibition of HBV repl icatio n.【Keywords! hepatitis B virus; dominant negative mutant; VP22【摘要】目的：了解VP22融合型显性负性(DN)突变体对抑制乙肝病毒(HBV) 复制的作用.方法：将VP22全长及其不同区段融合于HBV核心蛋白(HBc)的C 端，克隆入(-)构成DN突变体真核表达质粒.转染细胞后，免疫荧光鉴定 DN

6、突 变体在细胞内的表达，并以培养上清HBV表面抗原(HBsAg)的浓度为指标，观察DN突变体对HBV病毒复制的抑制效应.同时以MTTb匕色法观察转基因的表达对 宿主细胞生长状态的影响.结果：VP22及其不同区段构建的DN突变体可在细 胞中进行表达，且对宿主细胞无毒性.VP22融合型DN突变体可有效地抑制HBV 的复制，具有蛋白转导特性的DN突变体比无转导特性的DN突变体具有更强的抗 病毒能力.其中VP22全长构成的DN突变体具有最强的抑制效应，可使上清HBsAg浓度下降%. 结论：VP22融合型DN突变体可以增强DN突变体对HBV 复制的抑制.【关键词】 肝炎病毒，乙型；显性负性突变体；VP2

7、20引言全球目前有亿慢性乙型肝炎病毒(hep atitis virus B, HBV )感染者，每 年约有100万人死于HBV感染的相关疾病，占疾病死因的第 9位1.目前， 国际上尚无有效治疗慢性乙肝的手段.基因治疗技术的不断发展为抗HBV治疗 提供了新的思路和途径.其中显性负性(dominant negative ， DN)突变体的胞内 表达是HBV基因治疗的重要策略之一2-6 . Elliott 等7发现，单纯疱疹 病毒1(herpes simp lex virus type 1, HSV1)的结构蛋白VP 22(及其融合蛋白)可从培养基进入细胞内，并可不经过细胞细胞接触依赖性在同型或异型

8、细胞之间 转移.我们将HBV核心蛋白(HBV core p rote in, HBc) 与VP22进行融合构成 DN 突变体，以期利用VP22的蛋白转导特性进一步提高 DN突变体的抗病毒效应.1材料和方法材料质粒pVP22/mycHis2和(-)为Invitrogen 公司产品；EBOHB克隆有倍 HBV全长基因组为本室保存.限制性内切酶、连接酶购自TaKaRa Biotech ；鼠 抗HBc抗体和鼠抗cmyc抗体为SantaCruz公司产品，FITC标记的羊抗鼠IgG为 武汉博士德生物工程有限公司产品；DME培养基、进口胎牛血清以及LipofectinMine20XX购于GIBCO公司；固相

9、放免定量分析 HBsAg试剂盒为北京北免东雅生物技术研究所产品；其余化学试剂均为国产分析 纯.方法寡核苷酸合成所有寡核苷酸的合成均由 TaKaRaBiotech Co. Ltd完成.下 划线部分是为便于分子克隆操作而引入的限制性内切酶的识别序列，大写碱基为起始码或终止码. HBc1: 5 gcgcggtaccATGgacatcgaccctt3 (KpnI)；HBc2:5' gcgcctcgagTCAggatccacattgaggttccc35 gcccggatccatgacctctcgctccgtg35 ccccagatctatcgggactcgccatacc35 gccgagatct

10、gacgcggccacggcg3 (BamHI)； UR: (BglII) ； DS:(BglII) ； DR: (XhoI)； (XhoI, BamHI) ； US:5 gggcctcgagTTAcagctaatcctcttctgag3cmycl:5 gcccggatccgaacaaaaactcatctcagaagaggatctgTAActcgaggggc3 (BamHI, Xhol);cmyc2:5 gggcctcgagTTAcagatcctcttctgagatgagtttttgttcggatccgccc3Xhol, BamHI）.细胞培养细胞整合有完整的HBV基因组，能持续转录和翻译 H

11、BV基因，产 生HBsAg, HBeAg和Dane颗粒，由第四军医大学唐都医院传染科惠赠.细胞在含 有15 mL/L胎牛血清的DME培养基（含有终浓度为200 mg/L的G418）, 37C , 50 mL/L CO2条件下进行培养，2 d换液1次，6 d传代1次.载体构建本实验构建的载体主要有以下几种.pHBc :以载体EBOHB为模 板，HBc1和HBc2为引物扩增HBc编码序列.PCR产物经Kpnl/Xhol酶切后克隆 入（-），构成载体PHBc.pHVP22/M 将合成的cmyc1和cmyc2均调至浓度为 mmol/L，取等体积混匀，于100°C煮沸5 min并缓慢冷却至室温

12、退火形成双链.双 链cmyc片段经BamHI/XhoI酶切后连入经相同酶切的pHBc质粒，形成pHVP22/M. pHVP22/F: 质粒pVP22/mycHis2为模板，US/DF为引物扩增 VP22编码序列 全长及cmyc表位.PCF产物经BamHI/XhoI酶切后连入经相同酶切的pHBc质粒， 形成pHVP22/FpHVP22心BamHI单酶切质粒pHVP22/M并进行脱磷酸化处 理.以pVP22/mycHis2为模板，US/UF为引物扩增 VP22编码区上游102 bp的片 段，用BamHI/BglII酶切后连入pHVP22/M的BamHI位点.经鉴定为正向连接形 成的质粒命名为pHV

13、P22/U.pHVP22心 以pVP22/mycHis2为模板，DS/DR 为引物扩增VP22编码区下游102 bp的片段.PCR产物经BamHI/XhoI酶切后连 入经相同酶切的PHBc质粒，形成pHVP22/D.细胞转染参考GIBCO公司的LipofectinMine20XX 转染技术手册，将细胞以 2X 108/L接种于12孔培养板，每孔500卩L, 24 h后进行转染.LipofectinMine 20XX5 卩 L/孑L,DNA为 6 卩 L/孔.转染分为 7组：pHVP22/F, pHVP22/U, pHVP22/D, pHVP22/M, pHBc,（-）和空转染组，每组设3个复孔

14、.500 mL/L甘油的PBS封片,转基因表达的检测细胞以2X 108/L接种于内置有盖玻片的6孔培养板，细 胞转染48 h后将细胞置于冰上，吸取上清于-2 0C冻存.用PBS （4C，pH ）洗 涤贴壁细胞，弃去PBS以20 g/L多聚甲醛和1 g/L Triton 固定后于冰上放置 30 min. PBS 洗涤 2 次，每次 5 min，加入 1 mL 用 10 mL/L BSA/PBS 1 : 50稀释 的鼠抗HBc抗体（或cmyc抗体），4C湿盒过夜.PBS同上洗涤后加1 mL 1 : 80 稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG，PBS再次洗涤后以 荧光显微镜下观察并照相.转染细胞后留取上

15、清，应HBsAg式剂盒进行上清抗病毒效应分析为分析转染基因的抗病毒效应， 用北京北免东雅生物技术研究所的固相放免定量分析HBsAg含量的测定.由第四军医大学西京医院核医学科测定包被珠的放射性计 数，以每分钟计数（countings per minute ，CPM表示，利用标准品的CPM值与 浓度求出直线回归方程，据此得出各样品浓度.细胞毒性检测应用MTT比色法测定转染引起的细胞毒性作用.细胞转染后48 h,每孔加入5 g/L的MTT溶液20卩L,继续孵育4 h,每孔加入150卩L DMSO 终止培养，振荡10 min，使结晶物充分溶解.于酶联免疫检测仪检测 A490 nm, 记录结果.统计学处

16、理：数据用x±s表示，采用SPSS进行单因素方差分析以及LSDt 检验.P），即对HBV病毒复制没有抑制性作用.细胞毒性检测转染后48 h，于倒置显微镜下观察细胞的形态和生长状态， 发现各转染组细胞生长状态良好，无异常形态.MTT比色分析的统计结果也显示， 各组之间无显著性差异（P），进一步提示DN突变体的表达对宿主细胞的生长没 有影响（表1）.表1MTT比色测定结果（略）3讨论HBV感染是一个世界范围的卫生问题，我国是病毒性肝炎的高发区，针对HBV感染的治疗一直是研究的重点之一.但HBV前C基因的变异、丫MD位点的多 聚酶变异造成的耐药性9-10，给HBV抗感染治疗带来很大的困难.

17、基因工程 技术的发展，使得基因治疗在抗 HBV感染研究中具有更加重要的地位.DN突变 体即是基因治疗HBV感染的重要策略之一.将突变失活的特定基因导入受染细 胞，与野生型基因产物进行竞争以抑制其活性，从而达到抑制病毒复制的作用.该方法以蛋白作为效应分子，回避了以核酸为效应分子时遇到的HBV变异问题，因而成为具有优势的一种治疗策略.但是，在基因治疗时，往往因为没有足够的 治疗分子达到靶细胞而不能起到较好的治疗作用，本研究以具有蛋白转导特性的VP22蛋白与HBc融合构成DN突变体，以期利用VP22的蛋白转导性能提高治疗 效果，弥补治疗分子数量的不足.VP22是HSV1的一种结构蛋白，具有很强的细胞

18、间转移作用，可将与其融 合的蛋白分子高效地带入其转移的细胞7.具有蛋白转导活性的结构域 （Protein transduction domain, PTD）位于 VP22蛋白 C端的 34 氨基酸，与这段 序列融合的蛋白分子也可以被带入转移细胞.本研究中VP22蛋白C端的34个氨 基酸（即PTD）与 HBc构成的DN突变体可使HBsAg浓度下降%而N端的34个氨 基酸形成的DN突变体仅为%表明含有PTD的突变体比不含PTD突变体的抑制能 力强，VP22的蛋白转导性能可增强DN突变体作用.此外，以VP22全长构成的DN突变体（pHVP22/F）可使HBsAg浓度下降与 VP22的PTD构成的DN

19、突变体（pHVP22/D）相比具有显著差异（P）.由于二者均含 有PTD而抑制效率不同，提示在构建 DN突变体时HBc的C端融合的分子大小与 其病毒抑制能力有关，融合的分子越大其效应越强，原因可能是较大的融合蛋白 一方面具有较好的稳定性，另一方面可形成必要的空间位阻以抑制天然 HBc形成 核衣壳.值得注意的是当在HBc的C端只融合了 cmyc表位（pHVP22/M时，该DN突 变体不具有抑制HBV复制的能力，由于cmyc表位仅有10个氨基酸，推测HBc 的DN突变体在发挥病毒抑制作用时其 C端融合分子的大小有一个最小值，相关 的实验目前正在进行中.尽管融合较大的蛋白形成DN突变体具有更好的病毒

20、抑制能力，而且本研究 也证明了所构建的DN突变体对于宿主细胞的生长没有影响，但是在实际应用中， VP22毕竟是一种外源性蛋白分子，对于机体其他细胞尤其是免疫系统细胞是否 存在影响仍然需要做很多工作.基因治疗HBV感染虽然目前仍很不成熟11， 但为乙肝的治疗开辟了一个新天地，提供了新思路 .【参考文献】1 Pramoolsinsup C.J . J Gastroenterol Hepatol,Man ageme nt of viral hep atitis B 20XX,17(S upp l):S125-S145.2 von Weizsacker F, Kock J, Wieland S, et

21、 al. Dominant negative muta nts of the duck hep atitis B virus core p rotein in terfere with RNApregenome packaging and viral DNA synthesisJ . Hepatology,1999,30(1):308-315.3 von Weizsacker F, Wieland S, Kock J, et al. Gene therapy for chronic viral hep atitis: Ribozymes, an tise nse olig onu cleoti

22、des, anddominant negative mutantsJ . Hepatology,1997,26(2):251-255.4 Scaglioni P, Melegari M, Takahashi M, et al. Use of dominant n egative muta nts of the hepadn aviral core p rotein as an tiviral age ntsJ . Hepatology,1996,24(5):1010-1017.5 von Weizsacker F, Wieland S, Blum HE. Inhibition of viralrep licati on by gen etically engin eered muta nts of the duck hep atitis B virus core proteinJ . Hepatology,1996,24(2):294-299.6 Scaglioni PP, Melegari M, WandsJR. Characterizationof hepatitisB virus core mutants that inhibit viral replicationJ .Vi