V基因定量分析技术的应用价值、存在问题及展望

1、V基因定量分析技术的应用价值、存在问题及展望V基因定量分析技术的应用价值、存在问题及展望-HBV基因定量分析技术的应 用价值发布时间： 20XX-8-12 作者：缪晓辉 孔宪涛近年来HBV基因定量分析的价值受到越来越多研究者的重视。过去由 于过分强调了 HBV感染后过强的细胞免疫应答介导肝细胞损伤，忽视了对病毒复 制水平与致病性之间因果关系的研究。目前普遍认为，尽管HBV不直接破坏寄生 细胞，但病毒的活跃复制是启动或激发肝脏组织炎症反应的因素。这表明确定感染者体内HBV复制状态，即从HBV因定量的角度作病情分析是十分有意义的。 事实上，真正引起人们关注HBV因定量分析价值的重要原因是最近发现了

2、干扰 素治疗与HBV因水平两者之间有非常密切的关系。HBV因定量分析还在转基 因动物、基因治疗、蛋白疫苗和核酸疫苗、抗HBV药物体外试验和动物试验及耐 药研究、流行病学研究、HBV血液制品污染监测等方面具有重要的应用价值。一、HBVS因定量分析在干扰素治疗中的应用尚无药物可以清除所有HBV感染者体内HBV颗粒。干扰素是目前唯一 有一定疗效的一类生物制剂，它在病毒等诱导下由几种相关细胞产生，并发挥抗 病毒作用。但是无论使用何种干扰素，也无论治疗剂量或疗程如何，干扰素治疗 后HBV转阴率迄今仍保持在40流右，无法进一步提高，究竟有哪些制约因素起 作用尚无定论。近年来发现干扰素的治疗效果，即干扰素治

3、疗后的反应性 (res pon se) 很大程度上取决于HBV在体内的复制水平2,3。以下几点事实值得注意：治疗 前HBV氐水平复制者的反应性明显优于高水平复制者。HBV转阴的几乎都是那些治疗前血清HBV DNA含量较低者，而治疗前HBV DNA含量特别高者大多没有疗 效；治疗中病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。相反，治疗期间HBVS因水平下降较慢，或下降幅度较小，或变化不明显者，大多是无效者；治疗结束后， 采用PCR定量法检测，HBV DNA完全转阴者可能不再复发，而终止治疗后 HBV DNA仍保持较低水平者，反跳的可能性较大。可见，使用干扰素治疗HBV感染时，在各种近期和远期疗效指标中，

4、除了病人的临床表现是否好转，生化指 标(ALT)是否改善，肝组织炎症反应是否减轻等以外，血清HBV DNA定量分析是 一个十分重要的观察项目。从现有研究资料看，除病理检查外，HBV DNA定量检测，也许是干扰素治疗效果判断依据中最直接、最可靠和最有价值的指标。多 数研究者认为，通过HBV DNA定量分析来指导干扰素治疗，有重大意义。首先，在治疗对象的选择方面，即确定干扰素治疗适应症时，应对各侯选病例在某个时 间段内定期反复检？釮BV DNA水平，那些长期保持HBV高复制水平者不宜接 受干扰并素治疗，或应当联合治疗；其次，干扰素治疗期间，可根据HBV基因水平的动态变化适时调整治疗剂量，决定是否缩

5、短或延长疗程，及是否终止治疗。 这不仅对制订合理的治疗方案，也对减轻病人负担，避免不恰当用药有指导意义。 笔者认为，目前国际上普遍采用的所谓“六个月疗程”及某些中高剂量治疗方案 均缺乏充分和足够的立论依据，有必要结合基因定量分析结果，重新评价和制订 干扰素治疗计划；最后，干扰素治疗结束后，对有反应者定期作定量分析，有助 于发现复发者，并根据血清 HBV DNA含量波动情况决定是否实施再治疗。有人 报告，首次干扰素治疗有效者，再治疗的效果亦佳。如果第一次治疗无反应或反 应较差者，第二次干扰素治疗仍不能取得理想疗效。二、HBV基因定量分析的其他临床价值HBV感染后，在临床表现方面的差异非常明显，可

6、以表现为无症状携带 者、急性肝炎、慢性肝炎、暴发型肝炎、肝硬化及肝癌等多种疾病状态。病毒在 肝细胞内的复制水平与各种临床疾病状态之间可能存在着某些必然。由于HBV基因定量技术的发展和成熟，目前已有可能从某些现象上阐明 HBV 复制与致病性 之间的“量效”关系。“无症状携带者”可能为活动性乙肝患者。有部分 HBV感染者，由于免疫耐 受或其它原因，体内HBV呈复制不活跃的“潜伏”状态，但并不意味着不存在进 行性肝损害。Mels等研究发现无症状携带者在其自然发展史上，HBV复制处于波 动状态，时有加剧，病毒复制积累到一定程度后ALT水平增加。一般规律是：血HBV而且由直接向肝硬化和肝癌发清HBV D

7、NA水平上升？ ALT活性增加？ IgM抗HBc滴度提高。因此无症状携带 者应采取积极治疗措施，否则这类人群不仅作为重要的病毒库传播 于隐匿性肝细胞损伤的不断积累，不经过慢性肝炎阶段， 展。上述无症状携带者是一HBV DNA水平对预后判HBV DNA水平与HBV感染者病情和预后的关系密切。 个特殊群体。而对那些急性和慢性乙型肝炎患者而言，断有帮助。研究发现HBV DNA-直保持较高水平的急性肝炎患者易慢性化，而 HBVg制水平较高的慢性肝炎患者不仅对干扰素治疗的反应性差，而且肝组织炎症反应更明显，病情更重，更易发生肝硬化和肝癌。目前在能否用血清HBV DNA 水平来判断肝组织炎症损伤程度这类问

8、题上尚有争议。动物实验表明，鸭肝被 DHBr泛感染的同时，并不伴随明显病毒血症，肝细胞清除病毒的同时也无病毒 血症加重的证据。然而最近有人对 HCV感染者进行基因定量分析研究，发现 HCV RNA水平与ALT水平以及肝脏knodell分级之间有密切关系。肝移植者HBV DNA定量的意义Mazzaferro等报告肝移植前患者血清 HBV DNA水平的高低决定移植 后肝脏是否再感染HBV作者观察到，14例移植前血清HBV DNA含量低于103 拷贝/ml，移植后不间断地采用HBsAb免疫预防，随访36个月，无一例再发肝炎， 但另外两例移植前病毒拷贝数大于 105/ml则发生了严重HBV再感染。建议

9、移植 前使用抗HBV药物，最大限度降低血清HBV DNA浓度，有助于防止HBVg犯移 植后肝脏，提高肝脏移植的效果。前核基因突变HBV定量意义HBV前核基因突变可导致 HBeAg表达缺失。感染不表达 HBeAg勺HBV 突变株，或野生型HBV在体内突变并成为优势株均产生较严重的后果，如易发生暴发性肝炎，预后差，干扰素治疗无效等9,10。目前已能采用核酸序列测定技 术、PCF技术、限制性片段长度多态性(RFLP)分析技术等来定性检测HBV!核基 因突变。最近Baxall建立了一种PCR及产物的显色反应点突变分析技术 (Colourimetric point mutation assay)，用来定

10、量分析突变前核基因，有 助于进一步探讨HBV突变与致病性之间的关系11。基因定量分析是一项临床应用型技术，但对基础研究也有一定的应用 价值12，尤其是在当前基因治疗、转基因动物、核酸疫苗等热点研究领域，基 因定量分析可能是一种很好的辅助手段，对发现一些有意义的现象也许有一定帮 助。比如HBV在转基因小鼠组织脏器分布规律可用定量标准来衡量，以及用定量手段观察各种药物、细胞因子和其它物质对转基因小鼠 HBV因复制的调节作用。 又如对核酸疫苗注入肌组织后的各种动力学变化的研究远未深入，如能采用定量手段，分析抗原表达基因在体内的存在状态无疑是有益的。至于各种抗HBV药物，13。无论是在体外细胞模型(包

11、括转基因细胞模型)还是在动物模型的研究，或在人体 研究，采用基因定量分析，应当是考核药物疗效的最佳手段HBV因定量分析存在的问题及未来展望HBVS因定量技术的发展历史不长，但由于有定性技术为基础，以及 与其它学科方法的融汇，发展速度很快，目前趋于成熟。但应用定量技术去研究 HBV感染的临床问题还不充分，同时定量技术本身也有许多问题值得探讨。一、国际标准化。这是一个最为突出而又必须尽快解决的问题。欧洲有一个“病 毒性肝炎研究组” (European Study Group in Viral Hepatitis)，经常 向欧洲的某些研究机构提供 HBV血浆标准品作定量分析参考14。有必要在国际 上

12、设立统一的HBV基因标准品，包括各种HBV亚型的标准参照。笔者认为，克隆 的HBV DNA质粒不适宜作标准品。克隆HBV DNA与载体构成了闭环超螺旋结构， 而且，一级结构单一，这与体内存在的HBV基因结构差异很大。后者呈部分双链，如从高水平HBV阳性DNA可能是一个制备DNA定量技术精确性和在血清中尚有裂解片段及复制中间体等形式。 因此，无论是在分子杂交，还是在 PCF过程中，质粒HBV DNA吉构与人体内感染的HBV DNA吉构在杂交效率或扩 增效率上必然有细微差别，结果将影响定量分析的准确性。 病人血清大量抽提，或从转基动物血液中纯化得到HBV标准品的途径。总之，国际化的标准参照，是保证

13、HBV可靠性的前提。二、分子杂交定量技术和PCF定量技术应当共存下去吗？以下两点值得考虑：首先，有必要弄清体内HBV复制水平极低者（如低于1fg/ml）占HBV感染人数的 比例有多大？这类低水平复制者预后如何 ？如果这类人群属于急性感染恢复期， 或有自然清除病毒倾向者，那么似无必要作常规PCR定量分析，定期进行PCR定性检测即可。其次，有必要建立一种敏感度介于分子杂交和 PCR定量技术之间 的检测系统。最近有人利用电化学技术观察到 DNA双链互补杂交，甚至单个碱基 对结合时发生了微电反应，这给我们以很大启示，今后如有可能在这方面打开突 破口，那么基因定量分析两大技术共存的局面会发生转变。但是，

14、在目前这两大技术仍有很强的互补性。三、HBV突变株定量分析意义的研究。HBV基因突变15，尤其是前核基因突变， 直接影响HBV感染病情转归及抗毒治疗效果，同时也反映了来自体内或外界选择 压力的作用。因此，突变株在体内产生的确切原因，突变株与野生株混合存在的 发展趋向，突变株是否为耐药株，突变株与野生株相对含量的变化与致病性的关 系，突变株与免疫耐受的关系等均是有必要进一步澄清的问题。四、基因定量技术在HBV感染流行病学方面的应用16。HBV经血液传播致病 已十分明确，但是体液传播的问题还必须有充足的证据来补充。 体液及其它分泌 液或排泄物传播HBV是日常生活密切接后感染HBV的直接原因，但其中

15、必然存在HBV基因含量与使用血制品后感染 HBV“含量与传染性”的关系，那么这个致病的量值完全可以通过 HBV感染流行病学 研究得到确证。另外，被污染血制品中 的危险性之间的关系也值得研究。目前看来，所谓健康携带者或无症状带responders）,以及其他种种HBV在体五、加强HBV氐水平复制者预后研究。 病毒者、干扰素治疗部分反应者（partial内呈低复制状态者，在病情、机体免疫状态、预后等方面可能都有一些特殊性， 这类病人是否有自然清除病毒的倾向， 是否应当实施抗病毒治疗，是否成为重要 的传染源等问题都应该作出符合实际的回答。六、HBV复制水平与抗病毒药物疗效之间的关系研究有待深入。笔者

16、认为， HBV DNA水平与干扰素治疗效果之间的所谓在理论上缺乏根据，可能是一种表 面现象，有必要探讨其本质。病毒复制水平高低取决于病毒自身的生物活性和机体的免疫功能，应当从病毒和机体两方面寻找突破口，提高干扰素抗HBV的效果。 最后，在中国，有世界上为数最众的 HBV感染及相关慢性肝病患者， 就HBV定量技术而言，目前尚但我们在HBV感染诊治研究方面仍处于落后状态。 未建立分子杂交定量分析技术，现已报告的 今后有必要重视这方面的投资和开发。 应简单重复国外研究结果。就 HBV 现象已不鲜见，必须引以为 戒。PCR定量分析法也属于低水平重复， 在临床研究领域应当有自己的立足点， 不 DNA定量

17、分析意义的研究而言，简单重复的参考文献1.P awlotskyshould beJM; Bastie used for iA;rout ineWhat techniqueofHBV DNAincli nicalsamp les?Lonjon I, et al:detect ionand qua ntificati onJ-Virol-Methods. 1997;65:245.2. P errilloRP andMason AL:3.in fectio n.Brun ettorusun ableinchro nic4.B.5.of6.Gastroe nterolCli nThera py for

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