实验细胞骨架的观察ppt课件

1、一、考马斯亮兰一、考马斯亮兰R250染色法染色法【实验目的】 掌握用考马斯亮蓝R250Coomassie blue R250染色法察看植物细胞骨架的方法。 【实验原理】 细胞骨架是指存在于真核细胞中的蛋白细胞骨架是指存在于真核细胞中的蛋白纤维网架体系。其概念具有狭义和广义纤维网架体系。其概念具有狭义和广义之分：狭义的细胞骨架是指细胞质骨架之分：狭义的细胞骨架是指细胞质骨架包括微丝、微管和中间纤维；广义的细包括微丝、微管和中间纤维；广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。核骨架、核细胞膜骨架和细胞外基质。核骨架、核纤层与中间纤维在构造上

2、相互衔接，贯纤层与中间纤维在构造上相互衔接，贯穿于细胞核和细胞质的网架体系。穿于细胞核和细胞质的网架体系。【实验原理】 细胞骨架细胞骨架(Cytoskeleton) 组成：主要包括微组成：主要包括微管、微丝和中间纤维以及核骨架管、微丝和中间纤维以及核骨架-核纤层体系。核纤层体系。微管主要分布在核周围，呈放射状向周围分散，微管主要分布在核周围，呈放射状向周围分散，微丝主要分布于细胞质膜的内侧，而中间纤维微丝主要分布于细胞质膜的内侧，而中间纤维那么分布在整个细胞中。那么分布在整个细胞中。 细胞骨架作用：具有维持细胞形状构造和内部细胞骨架作用：具有维持细胞形状构造和内部构造的有序性、参与细胞运动、物

3、质运输、能构造的有序性、参与细胞运动、物质运输、能量转换、信息传送和细胞分裂等重要功能。量转换、信息传送和细胞分裂等重要功能。 细胞骨架的研讨方法：考马斯亮兰细胞骨架的研讨方法：考马斯亮兰R250染色染色法、荧光素标志的鬼笔环肽染色法、间接免疫法、荧光素标志的鬼笔环肽染色法、间接免疫荧光法等。荧光法等。 考马斯亮兰考马斯亮兰R250染色法的原理：考马斯亮蓝染色法的原理：考马斯亮蓝R250可以对各种蛋白质进展染色。细胞骨架可以对各种蛋白质进展染色。细胞骨架有一个特性，即用非离子去垢剂如有一个特性，即用非离子去垢剂如Triton X-100处置时，可以坚持非溶解形状。当处置时，可以坚持非溶解形状。

4、当用这类试剂处置细胞时，细胞内其它可溶性用这类试剂处置细胞时，细胞内其它可溶性的物质和膜成分都被抽提出来，只留下细胞的物质和膜成分都被抽提出来，只留下细胞骨架。考马斯亮蓝骨架。考马斯亮蓝R250虽不能对微丝进展特虽不能对微丝进展特异性染色，但当其它蛋白成分被抽提后，就异性染色，但当其它蛋白成分被抽提后，就能明晰地显示微丝束的形状。能明晰地显示微丝束的形状。Triton X-100SDS实验器材、资料和试剂光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染光学显微镜；烧杯、吸管、镊子、玻片染色缸、载玻片、盖玻片；色缸、载玻片、盖玻片；新颖洋葱新颖洋葱; 6mM磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液pH6.8、M缓冲液、缓冲

5、液、1%Triton X-100、0.2%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250、3%戊二醛。戊二醛。3%戊二醛用戊二醛用PBS配制配制实验步骤1、撕取洋葱鳞茎内表皮、撕取洋葱鳞茎内表皮(约约1平方厘米平方厘米)置于置于35ml pH6.8 磷酸缓冲液中待其下沉磷酸缓冲液中待其下沉(烧杯烧杯1) ；对照无；对照无PBS处置；处置；2、用、用35ml 1%Triton X-100处置处置20 min(烧杯烧杯2) ；对照无对照无1%Triton X-100的的M缓冲液处置缓冲液处置20min;3、吸去、吸去Triton X-100，用，用M缓冲液缓冲液35ml洗洗2次，每次，每次次5 min (烧杯烧杯3) ；对照无；对照无M缓冲液处置缓冲液处置;4、 35ml 3%戊二醛固定戊二醛固定20 min(烧杯烧杯4) ；5、pH6.8磷酸缓冲液磷酸缓冲液35ml洗洗2次，每次次，每次5 min，滤，滤纸吸去残液纸吸去残液(烧杯烧杯1) ；6、 35ml 0.2%考马斯亮蓝考马斯亮蓝R250染色染色15和和30分钟，分钟，然后用蒸馏水小心冲洗然后用蒸馏水小心冲洗12次次(烧杯烧杯5) ；做染色；做染色时间的影响；时间的影响；7、将表