利用诱导性NR1条件基因敲除小鼠研究NMDA受体在空间记忆提取中的作用

1、yiT论女第表&冢利用诱导性 NR1 条件基因敲除小鼠研究 NMDA 受体在空间记忆提取 中的作用【摘要】：大量研究表明，海马神经元突触的 NMDA 受体在空间记忆 的信息处理过程中起着重要的分子开关的作用。长期空间记忆与其它类型的长期记忆一样，可分为获得、巩固、储存及提取四个阶段，探 讨NMDA 受体在空间记忆不同阶段的功能，不仅有助于理解空间记 忆的形成过程和分子机制，还将对阐述记忆的本质等问题有重要启示 作用。药理学和遗传学的证据都揭示海马NMDA 受体的活性和NMDA 受体依赖的突触可塑性在动物空间记忆的获得、巩固和储存 阶段起着关键作用，在任务学习之前以及任务记忆的巩固和储存

2、阶段 阻断NMDA 受体的作用、或敲除 NMDA 受体的核心亚基 NR1 基因, 都将妨碍动物空间记忆的形成。但以往的工作对NMDA 受体在记忆提取过程中的作用还少有涉及。本文将 Cre/loxP 重组系统与四环素 操纵子中的人工转录活化因子 tTA 结合起来，即利用诱导性的条件基 因敲除技术（第三代基因敲除技术），构建了在海马 CA1 亚区和前脑区 特异性敲除 NR1 基因的小鼠，分别称 QA1-KO 小鼠和 iFB-KO 小鼠。 在这两种小鼠的染色体中，有 4 个基因位点同时被修饰。通过给小鼠 喂食正常食物或含强力霉素（doxycycline,简称 dox）的食物，可达到 在时间上对 NR

3、1基因的敲除进行调控，即给小鼠喂食含 dox 的食物 （6mg/g,下同）5 天后，可获得基因敲除的效果；反之，小鼠体内的 NMDA 受体活性则不受影响。通过原位杂交和免疫染色的方法，证实喂食 dox5 天后，QA1-K0 小鼠中的 NR1 基因敲除限定在海马的CA1 区，而 iFB-KO 小鼠中的 NR1 基因敲除则限定在前【关键词】： 学习与记忆空间记忆记忆提取前脑海马 CA1 区 NMDA 受体 NR1 基 因Cre/loxP 重组系统 Morris 水迷宫诱导性条件基因敲除条件性味觉 厌恶回避(CTA)【学位授予单位】：华东师范大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2006【分类号】

4、：Q789【目录】：摘要 5-8Abstract8-15 第一章利用 iCA1-KO 小鼠研究 NMDA受体在空间记忆提取过程中的作用 15-59 摘要 15-17 前言 17-20 第一 节材料与方法20-36 一构建转基因小鼠20-281.构建转基因小鼠的一 般方法20-222.Cre/ +转基因小鼠的构建 22-243.利用报告小鼠分析Cre 转基因表达的型式 24-264.tTA / +转基因小鼠的构建26-275.NR1-GFP/ +转基因 小鼠的构建 27-28 二.基因打 靶小鼠 fNR1 /fNR1 小鼠的构建 28-29 三.获得可诱导、海马 CA1 亚区 特异性 NR1 敲

5、除小鼠(QA1-K0 小鼠)29-32 四.QA1-K0 小鼠的检测 32-361.试剂材料与仪器设备 322.PCR 检测基因型 32-333 原位杂交检 测 NR1 基因敲除部位 33-344.免疫染色法检测 NR1-GFP 蛋白的表达yiT论女為表&冢345 水迷宫测试 34-36 第二节实验结果 36-55 .PCR 检测 Cre/+、LacZ/+、tTA/+、NR1-GFP/+及 fNR1 /fNR1 等小鼠的基因型结 果 36-37二.LacZ 染色显示 CA1-Cre/+转基因小鼠中 Cre 的表达仅在 海马的 CA1亚区 37-38 三.PCR 检测 QA1-KO 小鼠

6、的基因型结果 38-39四.原位杂交检测 dox 对 NR1 基因敲除的部位 39-40 五.免疫染色检测NR1-GFP 蛋白的表达 40-42 六.利用水迷宫实验检测 iCA1-KO 小鼠的空间记忆能力 42-55 第三节分析与讨论 55-59 第二章利用 iFB-KO 小 鼠研究 NMDA受体在空间记忆提取过程中的作用 59-88摘要 59-61 前言 61-62第一节材料与方法 62-67 一.构建转基因小鼠及基因打靶小 鼠 62-63 二.获得可诱导、前脑特异性 NR1 基因敲除小鼠(iFB-KO)63-65 三.iFB-KO 小鼠的检测 65-671.PCR 检测基因型 652 原位

7、杂交检测 NR1 基因敲除部位 653.免疫染色法检测 NR1-GFP 蛋白表 达654.行为学测试 65-674.1 水迷宫测试 65-664.2 条件性味道厌恶回避实验 66-67 第二节实验结果 67-83 一.LacZ 染色显示 FB-Cre/ +转基因小鼠中 Cre 在前脑中特异性表达 67-68 二.PCR 检测 iFB-KO 小鼠的 基因型 68-69 三.原位杂交检测 dox 对 NR1 基因敲除的部位 69-70 四.免疫染色检测 NR1-GFP 蛋白在 iFB-KO 小鼠的表达 70-71 五.利用水迷宫任务研究前脑 NR1 基因在小鼠空间记忆提取过程中的作用71-81六.

8、条件性味道厌恶实验测试 NR1 对味觉记忆的影响 81-83 第三节分 析与讨论 83-87 研究小结 87-88 第三章学习与记忆神经机制的研究进 展(综述)88-113 第 1 节学习与记忆的定义和类别 88-90 第 2 节学习与 记忆的解剖基础 90-942.1 陈述性记忆的神经环路 90-932.2 非陈述性记忆的神经环路 932.3工作记忆的解剖基础 93-94第 3节学习与记忆 的细胞机制一一突触可塑性 94-983.1Hebb 假说及其实验依据94-963.2LTP 与 LTD96-973.3LTP 的突触前机制与突触后机制 97-98 第 4节学习与记忆的分子机制 98-1074.1LTP 与 NMDA 受体 98-994.2NMDA受体依赖性 LTP 的分子机制 99-1044.3LTD 的分子机 制 1044.4 非陈述性记忆的分子机制 104-107第