遗传毒性的检测方法

1、遗传毒性的检测方法 随着分子生物学检测技术的飞快进展，对各种环境因子遗传毒性效应的生物检测在毒理学讨论中已占有非常重要的地位，它们在环境污染监测及环境庇护中发挥了乐观的作用。大量的遗传学分析办法被用于识别体细胞诱变剂、潜在的致癌剂，以及与人类健康相关的遗传转变，所涉及的办法已经超过200种。按照遗传毒性效应检测办法所涉及的终端指标范围，可以把它们划分为三大类。第一类检测基因突变；其次类检测染色体畸变，包括染色体结构和（或）数目的异样转变；第三类测定dna损伤的标记、如dna损伤修复、dna加合物的形成、姐妹染色单体交换、体细胞重组及dna链断裂等。 一、体外哺乳动物细胞正向基因突变实验 哺乳动

2、物体外培养细胞的基因实验常用的测试系统有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hgprt)、(tk）及na+/k+ atp酶（oua）基因位点。hprt位点突变分析常用法中国仓鼠肺细胞株（v79)和中国仓鼠卵巢细胞株（cho),tk位点突变分析常用小鼠淋巴细胞株（l5178y）和人类淋巴细胞株（tk6, wtk1等）,oua位点突变分析仅适用于cho。 提高该实验的敏感性，应以野生型细胞为首选，兼具增殖速度快、集落形成率高和培养条件低的特点，以缩短实验周期、降低费用。常用的细胞系有： 1小鼠淋巴瘤细胞l5178y。来源于小鼠白血病细胞，为近二倍体，细胞倍增时光为11小时，集落形成率70%，呈悬浮性生长。 2

3、中国仓鼠肺（v79)细胞。来源于中国仓鼠肺细胞，染色体数为221，细胞的倍增时光为1216小时，集落形成率为7595%。 3中国仓鼠卵巢（cho）细胞。来源于中国仓鼠卵巢细胞，染色体数21 (2n=22)，倍增时光为1214小时，其集落形成率可达88%，贴壁或悬浮生长。 本节将重点介绍v79/hgprt基因突变实验。 【原理】 在正常培养条件下，细胞对6-硫化鸟嘌呤(6-tg）的毒性作用敏感，不能在含有6-tg的培养环境中生存，但在致癌物和致突变物作用下，某些细胞x染色体上控制次鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hgprt）的结构基因发生突变，无法产生hgprt，从而使突变细胞对6-tg产生抗性作用。这些

4、突变细胞在含有6-tg的挑选性培养液中能继续分裂并形成集落。按照突变集落形成数，计算突变率以判定受试物的致突变性。 【材料】 1细胞。用法中国仓鼠肺细胞株（v79)。为了削减自发突变率，将野生型细胞接种于含次黄嘌呤及胸腺嘧啶、甲氨蝶吟、甘氨酸的mem培养液中培养1周，将野生型细胞群中存在的自发hgprt座位突变体挑选性杀灭。然后重新接种于mem培养液中。 2培养液。采纳mem(eagle）基础培养液或dmem培养液，含10及适量（100u/ml)、（100 ug/ml)。 3无钙镁磷酸盐缓冲液（无钙镁pbs, ph为7.27.4)。 成分：（kh2p04)0.20g （na2hpo412h20

5、) 2.89g （kcl) 0.20g （nacl)8.00g 双蒸水（压力蒸气灭菌）1000m1 高压消毒，121,0.103mpa,20分钟。 4edta消化液。用无钙、镁pbs配制。浓度为0.05%, edta浓度为0.02%,与edta溶液按1:1混合，-20储藏。 5受试物最好能溶于培养液。不能溶于培养液的可溶于(dmso)，其终浓度低于0.5%（v/v)。 6阳性对比物。按照受试物的性质和结构选用不同的阳性对比物，如不需s9代谢活化的阳性对比物：(ethyl methanesulphonate, ems)、( methyl methanesul-phonate, mms）和乙基亚硝

6、基脲( ethyl nitrosourea, enu）等；需要s9代谢活化的阳性对比物：3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene )、（cyclophosphamide, cp),n-亚硝基胍( n-nitroso-dimethylamine, mnng)、7,12-二甲基苯蒽(7,12-demethylbenzanthracene,7,12-dmba）和苯并（a)芘（benzo(a) pyrene，bap）等。 7. 6-tg。用0.5溶液配成1.0mg/ml,4储藏，终于用法浓度为5 ug/ml。 8大鼠肝混合功能氧化酶（s9)。 (1)诱导。选健康雄性成年sd或wister

7、大鼠，体重 200g左右，周龄约56周，将多氯联苯（pcb)溶于玉米油中，浓度为200mg/ml，诱导剂量为500mg/kg体重，1次腹腔注射，苯巴比妥钠和-萘黄酮结合也可作为诱导剂。 (2) s9制备。诱导后第五日断头处死动物。处死前12h停止饮食，但可自由饮水。用75消毒动物皮毛，剖开腹部。在无菌条件下，取出肝脏，去除肝脏的结缔组织，用新奇配制的冰冷的0.15mo1/l溶液淋洗肝脏，以除去能抑制微粒体酶活性的血红蛋白，弃去淋洗液，将肝脏放入盛有0.15mo1/l氯化钾溶液的烧杯里。按每克肝脏加入0.15mol/l氯化钾溶液3 ml。用电动匀浆器制成肝匀浆，再在低温高速离心机上，在4条件下，

8、以12000r/min离心10分钟，取其上清液即为s9组分，分装于无菌冷冻管中。每管2ml。储存于液氮生物容器中或-80冰箱中备用。 上述所有操作均在冰水浴中和无菌条件下举行。制备肝s9所用一切手术器械、器皿等，均经灭菌消毒。s9制成后，经无菌检查，测定蛋白含量（lowry法），每毫升蛋白含量不超过40mg为宜，并经间接致癌物（诱变剂）鉴定其生物活性合格后储藏于深低温或冰冻干燥，保存期不超过一年。 (3) s9混合液的配制。将制备的s9组分，以适当比例与辅助成分混合组成s9混合液。见表13-5。 9吉姆萨染液。取吉姆萨染料3.8g，置玛瑙乳钵中，加少量甲醇研磨。逐渐加甲醇至375 ml，待彻低

9、溶解后，再加125 ml甘油，放入37温箱中保温48小时。保温期间振摇数次，使充分溶解。取出过滤,2周后用法，作为吉姆萨染液原液。用法时，取1份吉姆萨染液原液，与9份1/15mol/l缓冲液（ph 6.8)混合。 【办法】 1细胞预备将5x105个细胞接种于含彻低培养液的直径为l00mm的平皿中，于37,5培养箱中培养24小时。 2接触受试物吸去培养皿中的培养液，用无钙镁pbs洗两次，加入2ml无血清培养液及一定浓度的受试物（需代谢活化者加入2ml大鼠肝匀浆s9混合液），置于培养箱中2小时，处理结束后吸去含受试物的培养液，用无钙镁pbs洗细胞两次，加入含10血清的培养液，在c02培养箱中继续培

10、养1922小时。 3表达将细胞用胰酶/edta消化，待细胞脱落后，加入含10血清培养液终止消化，混匀，放入离心管以8001000r/min的速度离心57分钟，弃去上清液，制成细胞悬液，计数，以5x105个细胞接种于直径为l00mm的平皿，3天后分传一次，仍接种5x105个细胞，培养3天后举行突变体的挑选及集落形成效率（cfe）的测定。 4细胞毒性测定将上述消化计数后的细胞每平皿接种200个，每组5个平皿，于37,5% co2条件下培养7天，固定，giemsa染色后，计数每个平皿的细胞集落数，以相对于溶剂对比组的集落形成率表示细胞毒性、即以溶剂对比的集落形成率为100%(1.00)，求出各检品实

11、验组的相对值。见公式13-15。 式中：a一相对集落形成率； b一实验组集落形成率； c一溶剂对比组集落形成率。 5突变体的挑选及集落形成率的测定表达结束后，消化细胞分离接种，每组5个平皿，每个平皿接种2x105个细胞，待细胞贴壁后加入6-tg，终浓度为5ug/ml，放入c02培养箱中培养810天后固定，giemsa染色，统计每个平皿内的集落数，并计算突变率（mf )。同时另做集落形成率测定，每平皿接种200个细胞，不加6-tg，每组5个皿。7天后固定染色，计算集落形成率。见公式13-16和公式13-17。 式中：d一集落形成率； e一实际存活的细胞集落数； f一接种细胞数。 式中：g一突变率； h一突变集落数； i一接种细胞数； d一集落形成率。 【结果与分析】 1阴性对比组（空白对比、溶剂对比）的集落形成率应高于50%，否则结果应不予采纳。 2各试验室选用的阳性对比突变率有一定范围，若受试物的结果为阴性或弱阳性时，阳性对比的诱变率应达正常值的下线以上，否则结果不能成立。 3当受试物的突