分子检测在非小细胞肺癌诊治中的应用（130页）2

1、2021/5/7122021/5/7肺癌肺癌n肺癌是最常见的肺原发性肺癌是最常见的肺原发性恶性肿瘤恶性肿瘤。n肺癌目前是全世界癌症死因的第一名。肺癌目前是全世界癌症死因的第一名。1995年年全世界有全世界有60万人死于肺癌，而且每年人数都在万人死于肺癌，而且每年人数都在上升，上升，2003年年世界卫生组织世界卫生组织（WHO）公布的死）公布的死亡率是亡率是110万万/年，发病率是年，发病率是120万万/年。年。n约约80%的肺癌为非小细胞肺癌（的肺癌为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）。）。Cancer Cell 2, 437 (Dec, 200

2、2)32021/5/7腺癌腺癌鳞鳞癌癌大大细细胞胞小小细细胞胞肺癌的传统分类观点肺癌的传统分类观点小细胞肺癌小细胞肺癌 (SCLC)非小细胞肺癌非小细胞肺癌 (NSCLC)腺癌腺癌鳞癌鳞癌大细胞癌大细胞癌42021/5/7腺癌腺癌鳞鳞癌癌大大细细胞胞小小细细胞胞肺癌的传统分类KRAS不不清清楚楚EGFRHER2BRAFALK fusionPIK3CAMEK1ROS fusionPDGFR amp肺腺癌的分子亚型肺腺癌的分子亚型 ( (20092009) )肺腺癌的分子分类52021/5/7分子靶向治疗分子靶向治疗n是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌位点是在细胞分子水平上，针对已经明确的致癌

3、位点( (该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也该位点可以是肿瘤细胞内部的一个蛋白分子，也可以是一个基因片段可以是一个基因片段) )，来设计相应的治疗药物，来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生药物进入体内会特异地选择致癌位点来相结合发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周作用，使肿瘤细胞特异性死亡，而不会波及肿瘤周围的正常组织细胞。围的正常组织细胞。n药物靶向治疗的效果取决于肿瘤内是否存在靶向药物靶向治疗的效果取决于肿瘤内是否存在靶向药物作用的分子靶点及其异常状态。药物作用的分子靶点及其异常状态。62021/5/7分子检测的意义分子检测的意义n肿瘤分子

4、靶向药物的发展，为肿瘤的治疗带来了肿瘤分子靶向药物的发展，为肿瘤的治疗带来了新的希望和手段，肿瘤个体化治疗的前景广阔，新的希望和手段，肿瘤个体化治疗的前景广阔，提高了对肿瘤病理诊断的要求，分子诊断是适应提高了对肿瘤病理诊断的要求，分子诊断是适应肿瘤治疗的未来发展方向。肿瘤治疗的未来发展方向。72021/5/7非编码区非编码区非编码区非编码区编码区编码区RNARNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点1 12 23 34 45 5加加 工工转转 录录mRNAmRNA前体前体成熟成熟mRNAmRNA加加 工工基因基因蛋白质蛋白质翻翻 译译从基因到蛋白示意图从基因到蛋白示意图82021/5/78从基因到蛋白

5、示意图从基因到蛋白示意图92021/5/7102021/5/7非小细胞肺癌相关分子突变非小细胞肺癌相关分子突变nEGFR突变nK-RAS突变nB-RAF突变nPI3K突变nALK突变nROS1突变nMET突变nHER2扩增nRET1突变n112021/5/7n9、 人的价值，在招收诱惑的一瞬间被决定。2022-1-102022-1-10Monday, January 10, 2022n10、低头要有勇气，抬头要有低气。2022-1-102022-1-102022-1-101/10/2022 11:31:14 PMn11、人总是珍惜为得到。2022-1-102022-1-102022-1-10J

6、an-2210-Jan-22n12、人乱于心，不宽余请。2022-1-102022-1-102022-1-10Monday, January 10, 2022n13、生气是拿别人做错的事来惩罚自己。2022-1-102022-1-102022-1-102022-1-101/10/2022n14、抱最大的希望，作最大的努力。2022年1月10日星期一2022-1-102022-1-102022-1-10n15、一个人炫耀什么，说明他内心缺少什么。2022年1月2022-1-102022-1-102022-1-101/10/2022n16、业余生活要有意义，不要越轨。2022-1-102022-1

7、-10January 10, 2022n17、一个人即使已登上顶峰，也仍要自强不息。2022-1-102022-1-102022-1-102022-1-10122021/5/7腺癌的驱动基因腺癌的驱动基因LCMC(美国)MSN(法国)中国日本EGFR17%13%40%50%KRAS22%28%7%15%ELM4-ALK7%2%7%5%BRAF2%2%2%1%HER21%1%NA3%PIK3CA1%1%4%NAPTENNANA6%NAMET扩增1%1%5%4%Nil46%33%29%22%Kris ASCO 2011 Planchard ELCC 2012 Wu JSMO 2011 Mitsud

8、omi JCCO 2010132021/5/7 97% 97%的基因突变互相排斥的基因突变互相排斥单个突变数ALKAKTBRAFEGFRHER2KRASMEK1METNRASPIK3CAALK (38)X1211AKT (1)XBRAF (9)X1EGFR (89)X13HER2 (3)XKRAS (114)X11MEK1 (2)X11MET AMP (3)XNRAS (2)XPIK3CA (6)XKris MG. et al. ASCO 2011, Abstract # CRA7506. 142021/5/7Lung Cancer.2014,84(2):121126中国1139例肺腺癌各基因

9、构成比图152021/5/7EGFR突变突变n 表皮生长因子受体（表皮生长因子受体（Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR）主要位于细胞膜上，属受）主要位于细胞膜上，属受体酪氨酸激酶家族。体酪氨酸激酶家族。 EGFR被配体激活后启动被配体激活后启动胞内该通路上的信号传导，经过细胞质中衔接胞内该通路上的信号传导，经过细胞质中衔接蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因蛋白、酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和的转录，指导细胞迁移、黏附、增殖、分化和凋亡。凋亡。 EGFR下游的信号转导通路主要有两条：下游的信号转导通路主要有

10、两条：一条是一条是Ras/ Raf/ MEK/ ERK-MAPK 通路，而通路，而另一条是另一条是PI3K/Akt/mTOR通路。通路。 162021/5/7172021/5/7 表皮生长因子受体表皮生长因子受体(EGFR)(EGFR)在肿瘤生长和分化中起重要作用在肿瘤生长和分化中起重要作用, ,其结构如图其结构如图a, a,当其被配体当其被配体EGFEGF活化时活化时, ,通过二聚化使胞内酪通过二聚化使胞内酪氨酸激酶结构域被激活氨酸激酶结构域被激活, ,从而受体被活化从而受体被活化( (图图b b、c) c)。 182021/5/7Tyrosine Tyrosine kinasekinase

11、Cancer associationsCancer associationsErbB1(EGFR)乳腺癌, 卵巢癌, 肺癌, 神经胶质瘤等ErbB2(HER2)乳腺癌, 卵巢癌, 胃癌, 肺癌,结直肠癌等ErbB3(HER3)乳腺癌ErbB4(HER4)乳腺癌, 颗粒细胞瘤192021/5/7TKTKTKerbB1HER1EGFRerbB2HER2erbB3HER3erbB4HER4No specific ligands - often acts as dimer partnerHeregulinsNRG2NRG3Heregulins-cellulinEGF, TGFa , b Celluli

12、nAmphiregulin, HB-EGF202021/5/7EGFR的配体的配体表皮生长因子表皮生长因子（EGF ）转转化化生长因子生长因子（TGF）双调蛋白双调蛋白（AR ）上皮调节蛋白（上皮调节蛋白（Epiregulin）肝素结合的表皮生长因子肝素结合的表皮生长因子(HB-EGF ) BTC ( betacelluin)表皮素表皮素(epiregulin，EPR)212021/5/7TKTKEGFR 在肿瘤细胞中在肿瘤细胞中Survival(anti-apoptosis)PI3-KSTAT3AKTPTENMEKGene transcriptionMAPKProliferation/mat

13、urationChemotherapy /radiotherapyresistanceAngiogenesisMetastasispYpYRASRAFSOSGRB2pYG1SMG2222021/5/7 促进肿瘤细胞的体内外增殖促进肿瘤细胞的体内外增殖 促进肿瘤新生血管的生成促进肿瘤新生血管的生成促进肿瘤的远地转移促进肿瘤的远地转移保护肿瘤细胞不进入凋亡保护肿瘤细胞不进入凋亡232021/5/7242021/5/7Normal CellCancerous CellUp RegulationMutationEGFR在恶性肿瘤中的表达在恶性肿瘤中的表达252021/5/7EGFREGFR突变状态已成

14、为患者能否在一线使用突变状态已成为患者能否在一线使用TKITKI药物的重要指标药物的重要指标262021/5/7EGFR突变相关靶向药物突变相关靶向药物n针对针对EGFREGFR所开发的分子靶向药物主要分两类所开发的分子靶向药物主要分两类: : 1. 1.小分子酪氨酸激酶抑制剂小分子酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(TKI)， 如吉非替尼（如吉非替尼（GefitinibGefitinib， 也称为易瑞沙也称为易瑞沙/Iressa/Iressa，阿斯利康）和厄罗替尼（，阿斯利康）和厄罗替尼（ErlotinibErlotinib，也称为特罗凯也称为特罗凯/Tarceva/Tarceva，罗氏制药，罗氏制

15、药) )，抑制，抑制EGFREGFR胞内区酪胞内区酪氨酸激酶活性；氨酸激酶活性； 2. 2.单克隆抗体单克隆抗体(mAb)(mAb)，如西妥昔（，如西妥昔（CetuximabCetuximab，也称为爱必，也称为爱必妥妥/Erbitux/Erbitux）和帕尼单抗（）和帕尼单抗（PanitumumabPanitumumab，也称为维克替比，也称为维克替比/Vectibix)/Vectibix)，与，与EGFREGFR胞外区结合，阻断依赖于配体的胞外区结合，阻断依赖于配体的EGFREGFR活化。活化。n上述药物通过不同途径阻断上述药物通过不同途径阻断EGFREGFR介导的细胞内信号通路，介导的细

16、胞内信号通路，从而抑制肿瘤生长、转移和血管生成，并促进肿瘤细胞凋从而抑制肿瘤生长、转移和血管生成，并促进肿瘤细胞凋亡，提高放化疗敏感性。亡，提高放化疗敏感性。 272021/5/7EGFR外显子突变外显子突变n大量研究资料表明大量研究资料表明EGFREGFR基因突变主要集中在酪氨酸激酶基因突变主要集中在酪氨酸激酶区区(tyrosine kinase coding domain(tyrosine kinase coding domain，18-2l18-2l外显子外显子) )，其中，其中1919外外显子多为框内缺失显子多为框内缺失(746-753)(746-753)性突变，约占所有突变的性突变，

17、约占所有突变的4545；2121外显子多为替代突变外显子多为替代突变( (主要是主要是L858R)L858R)，约占所有突变的，约占所有突变的4040。n目前普遍认为，这两个热点突变可以增强肿瘤细胞对目前普遍认为，这两个热点突变可以增强肿瘤细胞对TKITKI的敏感性，并且可作为的敏感性，并且可作为TKITKI治疗的有效预测指标。因此，治疗的有效预测指标。因此，检测检测EGFREGFR基因突变对于指导基因突变对于指导NSCLCNSCLC病人临床用药具有重病人临床用药具有重要的参考价值。要的参考价值。282021/5/7EGFR突变位点n第18外显子核苷酸2155G A突变n第19外显子如核苷酸2

18、235-2249Del、核苷酸2254-2277Del、核苷酸2236-2250Del、核苷酸2240-2257Del等共19个突变。n第20外显子核苷酸2369CT n第21外显子核苷酸2576TG292021/5/7EGFR的突变类型的突变类型Nature Reviews Cancer 2007;7:169-181302021/5/7EGFR基因突变频率分布基因突变频率分布Cheng L, et al. Mod Pathol. 2012; 25(3): 347-69.耐耐 药药敏敏 感感312021/5/7EGFR基因突变基因突变n突变率在突变率在33%33%左右，其中腺癌高达左右，其中腺

19、癌高达48%48%。n东方亚裔明显高于高加索人种、女性高于男性、东方亚裔明显高于高加索人种、女性高于男性、非吸烟高于吸烟非吸烟高于吸烟nEGFREGFR1919、2121外显子的突变占外显子的突变占95%95%左右左右nEGFR EGFR 变异使变异使EGFR EGFR 酪氨酸激酶酪氨酸激酶ATPATP结合位点的某结合位点的某些关键基团发生重构些关键基团发生重构, , 使得小分子酪氨酸激酶抑制使得小分子酪氨酸激酶抑制剂更易与之结合，增强了与剂更易与之结合，增强了与ATPATP竞争性抑制剂的竞争性抑制剂的相互作用相互作用。322021/5/7EGFR突变在蛋白上的位置突变在蛋白上的位置细胞外结构

20、域配体结合区跨膜结构域细胞内结构域TK结构域磷酸化外显子20 T790M点突变ATP结合区外显子19缺失突变外显子21 L858R点突变332021/5/7EGFR突变检测突变检测n适用范围适用范围 非小细胞肺癌非小细胞肺癌、胰腺癌、头颈部肿瘤、转移性肾癌患者，、胰腺癌、头颈部肿瘤、转移性肾癌患者，筛选筛选EGFREGFR突变患者，适用抗突变患者，适用抗EGFREGFR的靶向药物易瑞沙的靶向药物易瑞沙（IressaIressa，GefitinibGefitinib，吉非替尼片，吉非替尼片) )、它赛瓦（、它赛瓦（TarcevaTarceva，特罗，特罗凯）、达沙替尼（凯）、达沙替尼（dasat

21、inibdasatinib）。）。n结果判读结果判读 EGFR EGFR变异或缺失患者对这些药物有效；无突变者预后不变异或缺失患者对这些药物有效；无突变者预后不良。良。342021/5/7352021/5/7K-RAS突变检测突变检测 n RASRAS基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。基因是人体肿瘤中常见的致癌基因。RASRAS基因家族由基因家族由KRASKRAS、HRAS HRAS 和和NRASNRAS组成，基因家族的各成员相互间同组成，基因家族的各成员相互间同源性可达源性可达85%85%。RASRAS基因编码的蛋白质是基因编码的蛋白质是P21P21蛋白，分子量蛋白，分子量为为21KD21KD

22、，由，由188-189188-189个氨基酸组成。个氨基酸组成。P21P21蛋白位于细胞膜的蛋白位于细胞膜的内表面，具有内表面，具有GTPGTP酶活性，参于传导细胞增殖信号的调控酶活性，参于传导细胞增殖信号的调控系统。其激活状态为系统。其激活状态为GTPGTP结合状态，失活状态为结合状态，失活状态为GDPGDP结合结合状态，其转变为活动性致癌基因的主要部位是第状态，其转变为活动性致癌基因的主要部位是第1212、13 13 和和61 61 密码子的突变，密码子的突变， 其中以第其中以第12 12 密码子点突变最常见。该密码子点突变最常见。该基因的体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的基因的

23、体细胞突变常见于多种恶性肿瘤，在肺癌患者中的突变率为突变率为15-30%15-30%，在结直肠癌患者中为，在结直肠癌患者中为20-50% 20-50% 。362021/5/7K-RAS突变检测突变检测nKRASKRAS蛋白是蛋白是EGFREGFR信号传导通路中的一个关键的下游调信号传导通路中的一个关键的下游调节因子。在研究节因子。在研究EGFREGFR突变与吉非替尼治疗进展期突变与吉非替尼治疗进展期NSCLCNSCLC患者的疗效间的关系的过程中也发现了患者的疗效间的关系的过程中也发现了KRASKRAS基因点突变，基因点突变，而且研究表明，而且研究表明，KRASKRAS基因突变与基因突变与NSC

24、LCNSCLC对吉非替尼、厄对吉非替尼、厄罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关。最近的研究罗替尼等靶向治疗药物的原发性耐药有关。最近的研究还发现这还发现这KRASKRAS基因的突变使结直肠癌患者对西妥昔单抗基因的突变使结直肠癌患者对西妥昔单抗的治疗产生耐药性。因此检测的治疗产生耐药性。因此检测KRASKRAS基因的突变可作为基因的突变可作为EGFREGFR靶向治疗耐药性产生的重要预测指标。靶向治疗耐药性产生的重要预测指标。 372021/5/7K-RAS突变检测突变检测nNCCN 2011NCCN 2011年临床指南中明确指出：年临床指南中明确指出：KRASKRAS基因是人体肿基因是人体肿瘤中

25、常见的致癌基因。该基因突变常见于多种恶性肿瘤，瘤中常见的致癌基因。该基因突变常见于多种恶性肿瘤，NCCNNCCN还指出还指出KRASKRAS基因突变会使肺癌患者对基因突变会使肺癌患者对EGFREGFR酪氨酸酪氨酸激酶抑制剂产生耐药；使结直肠癌患者对抗激酶抑制剂产生耐药；使结直肠癌患者对抗EGFREGFR抗体类抗体类药物产生耐药。所以药物产生耐药。所以NCCNNCCN提出肿瘤患者接受提出肿瘤患者接受EGFREGFR靶向靶向药物治疗之前，必须进行药物治疗之前，必须进行KRASKRAS基因突变检测，根据检测基因突变检测，根据检测结果决定是否使用结果决定是否使用EGFREGFR靶向药物作为临床治疗措施

26、。因靶向药物作为临床治疗措施。因此此KRASKRAS基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降基因突变检测能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。低治疗费用，节省宝贵的治疗时间。 382021/5/7K-RAS突变检测突变检测n适用范围适用范围 结肠癌结肠癌、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌患者，用于爱必妥、胃癌、头颈癌、非小细胞肺癌患者，用于爱必妥或帕尼单抗等靶向药物的适用人群筛选。或帕尼单抗等靶向药物的适用人群筛选。n结果判读结果判读 临床上靶向新药爱必妥（临床上靶向新药爱必妥（ErbituxErbitux，西妥昔单抗）和帕尼单，西妥昔单抗）和帕尼单抗（抗（Panitumu

27、mabPanitumumab）仅适用于无突变的仅适用于无突变的K-RASK-RAS基因野生型基因野生型患者，对患者，对K-RASK-RAS突变患者无效突变患者无效。美国国立综合癌症网络。美国国立综合癌症网络（NCCNNCCN）将）将K-RASK-RAS检测列为检测列为结肠癌临床治疗指南结肠癌临床治疗指南。392021/5/7K-RAS突变检测n突变位点402021/5/7nKRASKRAS突变是晚期突变是晚期NSCLCNSCLC小分子小分子TKI-TKI-抑制剂不能抑制剂不能获益的预测因子获益的预测因子nKRASKRAS突变是早期突变是早期NSCLCNSCLC辅助化疗不能获益的预测辅助化疗不能

28、获益的预测因子因子关于关于KRAS的共识的共识412021/5/7EML4-ALK融合基因检测融合基因检测 nEML4-ALKEML4-ALK融合基因为间变性淋巴瘤激酶融合基因为间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma anaplastic lymphoma kinase,ALKkinase,ALK）基因和棘皮动物微管相关蛋白样基因和棘皮动物微管相关蛋白样4 4（echinoderm echinoderm microtubule associated protein like4,EML4microtubule associated protein like4,EML4）基因融合

29、而成的具有致）基因融合而成的具有致瘤性的变异基因。瘤性的变异基因。ALKALK基因具有促进细胞增殖作用，基因具有促进细胞增殖作用，EML4EML4基因可维持细胞结构形态。基因可维持细胞结构形态。EML4-ALKEML4-ALK融合基因由第融合基因由第2 2号染号染色体短臂插入引起，肺癌中有色体短臂插入引起，肺癌中有9 9种种EML4-ALKEML4-ALK变异体存在，变异体存在，这些融合基因的这些融合基因的ALKALK部分均为部分均为2020号外显子编码细胞内酪氨号外显子编码细胞内酪氨酸激酶结构基因片段，而酸激酶结构基因片段，而EML4EML4部分包括不同外显子的片段部分包括不同外显子的片段基

30、因。基因。422021/5/7 在在6%-7%6%-7%非小细胞肺癌中已确定了几种非小细胞肺癌中已确定了几种EML4-ALKEML4-ALK 融合变异体，并证明其融合变异体，并证明其具有功能活性。具有功能活性。 转化需要转化需要ALKALK酪氨酸激酶的活性。酪氨酸激酶的活性。 证据表明证据表明ALKALK抑制剂可致体内肿瘤缩小，提示癌基因依赖，可以作为潜在抑制剂可致体内肿瘤缩小，提示癌基因依赖，可以作为潜在的靶点。的靶点。ALKALKALKALKALKALKALKALKALKALKEML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4EML4TFGKIF5B卷曲螺旋结构域酪氨酸激酶结构域E1

31、3;A20E6;A20E20;A20E14;A20E18;A20E15;A20E2;A20KIF5B-ALKE17;A20TFG-ALKEML4-ALKEur J Cancer 2010; 46:1773-1780EML4-ALKEML4-ALK融合基因融合基因432021/5/7ALK 阳性阳性 vs ALK 阴性阴性J Thorac Oncol. 2012;7: 9097Years since diagnosisPFS/RFS曲线FISH(positive) versus FISH(negative)Years since diagnosisPFS/RFS曲线IHC3(positive)

32、versus IHC0/1 (negative)442021/5/7ALK阳性EGFR突变驱动基因ALK融合基因融合基因EGFR突变突变临床&病理特征年轻、腺癌（粘液型）、年轻、腺癌（粘液型）、不吸烟不吸烟东亚裔、腺癌（非粘东亚裔、腺癌（非粘液型）、不吸烟液型）、不吸烟患者预后差差好好治疗方法克唑替尼克唑替尼EGFR-TKIs452021/5/7 通常情况下，通常情况下，EML4-ALKEML4-ALK 融合与融合与EGFREGFR 突变或突变或KRASKRAS 突变相互排斥，但也有报告发现突变相互排斥，但也有报告发现EML4-ALKEML4-ALK 融合与这融合与这些突变共存的病例些

33、突变共存的病例1-31-3 尽管组织尽管组织/ /吸烟史与吸烟史与ALKALK状态之间存在相关性，但是任状态之间存在相关性，但是任何非小细胞肺癌患者都有可能具有何非小细胞肺癌患者都有可能具有ALKALK阳性阳性 在高龄具有吸烟史的患者中（在高龄具有吸烟史的患者中（ 7676岁）发现岁）发现 了了EML4-EML4-ALK ALK 融合融合 1 1 仅凭临床特征可能无法发现所有患者，因此仍然需仅凭临床特征可能无法发现所有患者，因此仍然需要进行分子检测以确定要进行分子检测以确定ALKALK 状态状态1. Rodig et al., Clin Cancer Res. 2009;15:5216-522

34、32. Shaw et al., J Clin Oncol. 2009; 27:4247-42533. Zhang et al. Molecular Cancer 2010, 9:Article #188462021/5/7中国中国ALK阳性非小细胞肺癌诊断专家共识（阳性非小细胞肺癌诊断专家共识（2013版）版）nALKALK阳性非小细胞阳性非小细胞肺癌肺癌的共识：的共识：ALKALK阳性非小细胞阳性非小细胞肺癌肺癌是是指包括指包括ALK FISHALK FISH检测、或检测、或ALKALK序列融合变异、或序列融合变异、或ALKALK融融合蛋白合蛋白IHCIHC特定方法检测阳性的特定方法检测阳

35、性的肺癌肺癌，是非小细胞，是非小细胞肺癌肺癌的的一个分子亚型，常见于腺癌，该类患者通常可从一个分子亚型，常见于腺癌，该类患者通常可从ALKALK抑制抑制剂治疗中获益。剂治疗中获益。n目前常用的目前常用的ALKALK基因变异或融合蛋白检测方法分为以下三基因变异或融合蛋白检测方法分为以下三种：荧光原位杂交（种：荧光原位杂交（FISHFISH）技术、免疫组织化学（）技术、免疫组织化学（IHCIHC）和基于和基于PCRPCR的方法（包括的方法（包括qRT-PCRqRT-PCR、RACE-PCRRACE-PCR或特异性或特异性RT-PCRRT-PCR联合测序技术）。联合测序技术）。472021/5/74

36、82021/5/7FISH检测检测ALK判读判读n两种探针分别标记两种探针分别标记ALKALK基因的两端，基因的两端，300kb300kb的的33端和端和442kb442kb的的55端分别标记为橘红色和绿色。在无端分别标记为橘红色和绿色。在无ALKALK融合基融合基因表达的肿瘤细胞中，橘红色和绿色重叠为黄色或者相互因表达的肿瘤细胞中，橘红色和绿色重叠为黄色或者相互粘合（两个信号之间的间隔小于两个信号的直径）；而在粘合（两个信号之间的间隔小于两个信号的直径）；而在存在存在ALKALK融合基因表达的肿瘤细胞中，橘红色和绿色信号融合基因表达的肿瘤细胞中，橘红色和绿色信号相互分离（间隔相互分离（间隔2

37、 2个信号直径）。标本个信号直径）。标本FISHFISH阳性结果的阳性结果的判定标准为单个视野中的判定标准为单个视野中的5050个个肺癌肺癌细胞中至少有细胞中至少有2525个存在个存在分离信号，或者两个不同视野中的分离信号，或者两个不同视野中的100100个个肺癌肺癌细胞中至少细胞中至少有有1515个存在分离信号。个存在分离信号。n适用的组织样本要求：适用的组织样本要求：1010中性福尔马林固定后石蜡包埋中性福尔马林固定后石蜡包埋标本（标本（FFPEFFPE样本），防脱玻片切片厚度样本），防脱玻片切片厚度35m35m。492021/5/7B-RAF突变检测突变检测 nB-rafB-raf是癌基

38、因，编码一种丝是癌基因，编码一种丝/ /苏氨酸特异性激酶，是苏氨酸特异性激酶，是RAS-RAS-RAF-MEK-ERK-MAPKRAF-MEK-ERK-MAPK通路重要的转导因子，在多种人类通路重要的转导因子，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌、肺癌、甲状腺癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的癌、肝癌及胰腺癌等均存在不同比例的B-rafB-raf基因突变。基因突变。n约约66%66%恶性黑色素瘤和恶性黑色素瘤和1515的结肠癌中的结肠癌中B-rafB-raf基因存在体细基因存在体细胞错义突变。大约胞错义突变。大约80-90%80-90

39、%的的B-rafB-raf基因突变发生在基因突变发生在exon15exon15的的17991799核苷酸上，核苷酸上，T T突变为突变为A A，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸，导致其编码的谷氨酸由缬氨酸取代取代(V600E)(V600E)。目前认为，。目前认为，V600EV600E突变可模拟突变可模拟T599T599和和S602S602两两个位点的磷酸化过程，从而使个位点的磷酸化过程，从而使B-rafB-raf蛋白异常激活。蛋白异常激活。nB-rafB-raf突变状态与多种肿瘤的发生、发展及临床结局有关。突变状态与多种肿瘤的发生、发展及临床结局有关。随着随着B-rafB-raf突变研究的深入，可望

40、为阐明肿瘤发生的分子机突变研究的深入，可望为阐明肿瘤发生的分子机制，寻找新的治疗途径与靶点提供思路。制，寻找新的治疗途径与靶点提供思路。502021/5/7B-RAF突变检测突变检测n适用范围适用范围 甲状腺癌甲状腺癌、恶性黑色素瘤恶性黑色素瘤、卵巢癌、卵巢癌、结直肠癌结直肠癌等等 n结果判读结果判读 B-RAFB-RAF基因基因突变突变的患者接受的患者接受EGFR-TKIEGFR-TKI药物治疗的有药物治疗的有效率效率低低； B-raf B-raf V600EV600E突变突变可导致部分可导致部分K-RASK-RAS基因野生型患者对基因野生型患者对EGFR-TKIEGFR-TKI及及EGFR

41、EGFR单抗药物治疗单抗药物治疗不敏感。不敏感。512021/5/7PI3K突变检测突变检测 n磷脂酰肌醇磷脂酰肌醇-3 -3激酶（激酶（PI3KPI3K）是催化肌醇基团磷酸化的激）是催化肌醇基团磷酸化的激酶，由催化亚基和调节亚基组成的异二聚体；根据其底酶，由催化亚基和调节亚基组成的异二聚体；根据其底物结构不同分物结构不同分I I、II II和和IIIIII型。型。PI3KPI3K是是EGFREGFR下游信号分子，下游信号分子，可被生长因子受体酪氨酸激酶（如可被生长因子受体酪氨酸激酶（如EGFREGFR）激活，使丝）激活，使丝/ /苏氨酸激酶（苏氨酸激酶（AKTAKT）磷酸化而上调该通路的活性

42、并产生）磷酸化而上调该通路的活性并产生多种生物学效应，包括调节细胞增殖、存活和细胞周期多种生物学效应，包括调节细胞增殖、存活和细胞周期调控等。调控等。522021/5/7PI3K突变检测突变检测nPI3KPI3K是由调节亚基是由调节亚基p85p85和催化亚基和催化亚基p110p110组成的异源二聚组成的异源二聚体。体。PIK3CAPIK3CA编码编码PI3KPI3K的的p110p110催化亚基，它是目前催化亚基，它是目前PI3KPI3K家族成员中发现的唯一一个可以发生体细胞突变家族成员中发现的唯一一个可以发生体细胞突变而致癌的基因。大量数据表明而致癌的基因。大量数据表明PIK3CAPIK3CA

43、中存在两个热点中存在两个热点突变区：一个是位于突变区：一个是位于9 9号外显子的号外显子的E542KE542K和和E545KE545K突变，突变，另一个是位于另一个是位于2020号外显子的号外显子的H1047RH1047R突变；这两个突变突变；这两个突变热点都能增强热点都能增强PI3KPI3K的脂质激酶活性。的脂质激酶活性。532021/5/7PI3K突变检测突变检测n已发现在多种癌症中已发现在多种癌症中( (如乳腺癌、非小细胞肺癌等如乳腺癌、非小细胞肺癌等) )存在存在PI3KPI3K基因突变，基因突变，PI3KPI3K基因突变导致基因突变导致PI3K/AktPI3K/Akt信号通路信号通路

44、持续性活化。持续性活化。PI3KPI3K作为作为EGFREGFR下游信号分子被激活，导下游信号分子被激活，导致肿瘤细胞对致肿瘤细胞对EGFR-TKIEGFR-TKI等药物的耐药。所以，检测等药物的耐药。所以，检测PI3KPI3K基因突变可以预测肿瘤患者对基因突变可以预测肿瘤患者对EGFR-TKIEGFR-TKI等药物的等药物的耐药性。耐药性。542021/5/7PI3K突变检测突变检测n赫赛汀赫赛汀(Herceptin) (Herceptin) 是一种抗是一种抗HER2HER2单克隆抗体，可选择单克隆抗体，可选择性作用于人类表皮生长因子受体性作用于人类表皮生长因子受体2 2（HER2HER2）

45、，从而干扰），从而干扰癌细胞的生物学进程，抑制癌细胞的增生。癌细胞的生物学进程，抑制癌细胞的增生。n研究发现赫赛汀对研究发现赫赛汀对PIK3CAPIK3CA基因突变人群的疗效欠佳。基因突变人群的疗效欠佳。PIK3CAPIK3CA基因突变检测可为乳腺癌和肺腺癌患者的合理基因突变检测可为乳腺癌和肺腺癌患者的合理用药提供参考依据。用药提供参考依据。 552021/5/7PI3K突变检测突变检测n适用范围适用范围 乳腺癌、非小细胞肺癌乳腺癌、非小细胞肺癌n结果判读结果判读 PIK3CAPIK3CA基因突变人群赫赛汀治疗效果欠佳基因突变人群赫赛汀治疗效果欠佳562021/5/7ROS1 基因突变基因突变

46、n全称全称 c-ros c-ros 原癌基因，一种跨膜的受体酪氨酸激酶基因。在成人肾脏、原癌基因，一种跨膜的受体酪氨酸激酶基因。在成人肾脏、小脑、外周神经、胃、小肠、结肠细胞小脑、外周神经、胃、小肠、结肠细胞 ROS1 ROS1 蛋白高表达状态。在正常的蛋白高表达状态。在正常的人肺组织中，还没有发现人肺组织中，还没有发现 ROS1 ROS1 蛋白表达。蛋白表达。 nROS1 ROS1 染色体的重排可以激活染色体的重排可以激活 ROS1 ROS1 激酶活性。非小细胞肺癌激酶活性。非小细胞肺癌 (NSCLC) (NSCLC) 、胆管癌、胃癌及卵巢癌等中存在、胆管癌、胃癌及卵巢癌等中存在 ROS1

47、ROS1 的染色体重排。的染色体重排。ROS1 ROS1 重排的重排的 NSCLC NSCLC 患者的临床特征在研究中也被总结归纳，其主要特征是患者患者的临床特征在研究中也被总结归纳，其主要特征是患者相对相对比较年轻、无吸烟史、以肺腺癌为主比较年轻、无吸烟史、以肺腺癌为主。n研究显示研究显示 ROS1 ROS1 融合基因是融合基因是 NSCLC NSCLC 的致癌基因之一，而克唑替尼可以的致癌基因之一，而克唑替尼可以显著抑制显著抑制 ROS1 ROS1 的磷酸化水平，且这种抑制显现出浓度梯度依赖性现象。的磷酸化水平，且这种抑制显现出浓度梯度依赖性现象。所有的所有的ROS1ROS1融合阳性肿瘤缺

48、乏融合阳性肿瘤缺乏EGFREGFR、 K-RASK-RAS、HER-2HER-2、ALKALK和和RETRET基因基因改变改变 N Engl J Med. 2014,371:1963-71 572021/5/7n目前发现目前发现2 2种种ROS1ROS1基因融合基因融合(SLC34A2-ROS1(SLC34A2-ROS1和和CD74-ROS1)CD74-ROS1)。 SLC34A2-ROS1SLC34A2-ROS1融合基因存在融合基因存在2 2种变异体，均表达为一种具有两个跨膜种变异体，均表达为一种具有两个跨膜结构域的蛋白。结构域的蛋白。CD74-ROS1CD74-ROS1基因融合为在非吸烟的

49、女性腺癌患者中发基因融合为在非吸烟的女性腺癌患者中发现，现， 在成纤维细胞以及在成纤维细胞以及NSCLCNSCLC细胞系中验证了细胞系中验证了CD74-ROS1CD74-ROS1融合基因融合基因的致癌能力：的致癌能力：CD74-ROS1CD74-ROS1融合基因的异位表达能够在体外诱导高侵袭融合基因的异位表达能够在体外诱导高侵袭性，并且在体内诱导转移的形成。性，并且在体内诱导转移的形成。n最近发现最近发现ROS1ROS1重排在重排在NSCLCNSCLC中的频率约为中的频率约为2%2%。ROS1ROS1基因融合患者的基因融合患者的临床特征与临床特征与ALKALK易位患者的临床特征非常相似。易位患

50、者的临床特征非常相似。ROS1ROS1融合阳性的肿融合阳性的肿瘤患者更倾向于吸烟较少者瘤患者更倾向于吸烟较少者(10(10包年包年) )或不吸烟者，且与年轻、腺癌或不吸烟者，且与年轻、腺癌组织学类型相关。已知的融合蛋白中保留了组织学类型相关。已知的融合蛋白中保留了ROS1ROS1基因的激酶活性，基因的激酶活性，且且ROS1ROS1重排与其他已知的重排与其他已知的NSCLCNSCLC致癌事件如致癌事件如KRASKRAS突变、突变、EGFREGFR突变突变或是或是ALKALK突变并不重叠。突变并不重叠。582021/5/7NSCLC:14种种ROS1基因融合类型基因融合类型592021/5/7De

51、mographics and Clinical Characteristics of Patients With ROS1-Positive NSCLCAll PatientsROS1 PositiveROS1 Negative (n = 1,073)(n = 18)(n = 1,055)Demographic or Clinical CharacteristicNo. %No. %No. %P (ROS1 positive v ROS1 negative)Age, yearsMedian6249.862.3.001Range32-8732-7932-87SexMale523497395164

52、90.48Female55051116153951Smoking historyNever-smoker23922147822521.001Light smoker62616616Smoker6956521169366NA77716767PathologyAdenocarcinoma6946518100676640.019Squamous200190020019NSCLC, NOS59500596Adenosquamous10100101Other38400384NA72700727 Abbreviations: NA, not available; NOS, not otherwise sp

53、ecified; NS, not significant; NSCLC, nonsmall-cell lung cancerROS1 ROS1 基因融合主要发生于年轻、非吸烟、腺癌患者基因融合主要发生于年轻、非吸烟、腺癌患者J Clin Oncol. 2012; 30:86370ROS1基因融合临床病理学特性基因融合临床病理学特性602021/5/7细胞学证据细胞学证据l crizotinib可以有效抑制ROS1 基因融合细胞系活性Bergethon K et al. J Clin Oncol. 2012; 30:86370612021/5/7病人疗效证据病人疗效证据 支气管肺泡癌患者；支气管

54、肺泡癌患者； 无无EGFR EGFR 突变或突变或ALK ALK 变异；变异； 存在存在ROS1 ROS1 基因融合；基因融合； crizotinibcrizotinib标准剂量治疗；标准剂量治疗； 一周内，症状显著改善；一周内，症状显著改善； 八周评估接近完全缓解；八周评估接近完全缓解； 治疗六个月时，继续治疗，治疗六个月时，继续治疗，无复发证据；无复发证据；crizotinib治疗前crizotinib治疗12周J Clin Oncol. 2012; 30:86370622021/5/7RET基因突变基因突变n RETRET蛋白由蛋白由RETRET原癌基因编码，是一种酪氨酸激酶识别受体原癌

55、基因编码，是一种酪氨酸激酶识别受体，它在恶性肿瘤形成过程中起着重要作用。一些多重激酶抑，它在恶性肿瘤形成过程中起着重要作用。一些多重激酶抑制剂例如凡德他尼和索拉非尼对制剂例如凡德他尼和索拉非尼对RETRET异常的恶性细胞具有重要异常的恶性细胞具有重要的抑制作用。的抑制作用。n新近研究证实了新近研究证实了KIF5B-RETKIF5B-RET融合型非小细胞肺癌（融合型非小细胞肺癌（NSCLCNSCLC）的存在，并提示嵌合性癌基因可成为肺癌个体化诊治中新的的存在，并提示嵌合性癌基因可成为肺癌个体化诊治中新的分子靶点。分子靶点。n国外数据分析国外数据分析667667例肺癌中，例肺癌中，KIF5B-RE

56、TKIF5B-RET基因融合频率约为基因融合频率约为1.8%1.8%（12/66712/667例），而在没有例），而在没有EGFREGFR、KRASKRAS、HER2HER2、ALKALK、ROS1ROS1变异的肺癌中，变异的肺癌中，RETRET基因的融合频率高达基因的融合频率高达6.3%6.3%（10/15910/159例）。例）。Nat Med 2012，18(3): 382632021/5/7642021/5/7HER2基因突变基因突变 Her2Her2是人类表皮生长因子受体是人类表皮生长因子受体2 2基因，位于基因，位于1717号染色体号染色体17q11.2-2117q11.2-21，

57、编码一个分子量为，编码一个分子量为185kD185kD的跨膜糖蛋白。的跨膜糖蛋白。HER-2HER-2被证实在乳腺癌、胃癌和其它肿瘤上扩增和过表达。被证实在乳腺癌、胃癌和其它肿瘤上扩增和过表达。其扩增和过表达被认为是乳腺癌最重要预后和化疗标记。其扩增和过表达被认为是乳腺癌最重要预后和化疗标记。大约有大约有1%1%肺腺癌有肺腺癌有HER-2HER-2基因扩增。基因扩增。Her2Her2受体的过度表达受体的过度表达在细胞向肿瘤转化和肿瘤发生中起着关键性作用。在细胞向肿瘤转化和肿瘤发生中起着关键性作用。652021/5/7Her-2基因基因l 致癌基因：致癌基因：Her-2基因；基因；l 位点：位点

58、：17q11.2-q12；l 编码蛋白：跨膜蛋白（与编码蛋白：跨膜蛋白（与 表皮生长因子受体部分同表皮生长因子受体部分同源）；源）；l 约约1%肺腺癌病人有肺腺癌病人有HER-2的扩增；的扩增；l HER-2基因扩增是决定基因扩增是决定Herceptin治疗治疗是否有效的关键是否有效的关键性指标。性指标。662021/5/7信号传导信号传导至细胞核至细胞核细胞核细胞核接合部接合部酪氨酸激酶酪氨酸激酶活性部分活性部分细胞质细胞质细胞膜细胞膜生长因子（配体）生长因子（配体）癌基因活化癌基因活化细胞分裂细胞分裂HER2 受体跨膜二聚体的信号传导途径受体跨膜二聚体的信号传导途径672021/5/7nH

59、ER-2HER-2的水平是以阿霉素为基础药物化疗重的水平是以阿霉素为基础药物化疗重要而独立的预后因子。要而独立的预后因子。nHer2Her2阳性在治疗上的意义：阳性在治疗上的意义： 预测对含蒽环类治疗方案的敏感性预测对含蒽环类治疗方案的敏感性 预测对紫杉类治疗的敏感性预测对紫杉类治疗的敏感性 预测对预测对CMFCMF（环磷酰胺、氨甲喋呤、（环磷酰胺、氨甲喋呤、5- 5-氟尿氟尿嘧啶）治疗方案的耐药嘧啶）治疗方案的耐药682021/5/7n目前检测目前检测HER-2HER-2基因扩增或基因扩增或HER-2HER-2蛋白过度表达的方法有蛋白过度表达的方法有许多种。许多种。FISHFISH检测是使用

60、传统分子生物学方法检测肿瘤组检测是使用传统分子生物学方法检测肿瘤组织的织的DNADNA。FISHFISH在荧光显微镜下可以确认出肿瘤所在的在荧光显微镜下可以确认出肿瘤所在的位置，就各种检测方法比较位置，就各种检测方法比较FISHFISH为最好，被喻为为最好，被喻为HER-2HER-2水水平检测的金标准。平检测的金标准。 nHER-2 HER-2 免疫组织化学免疫组织化学+的意思是肿瘤组织在免疫组织化的意思是肿瘤组织在免疫组织化学染色下着色强度为学染色下着色强度为2 2价。多数认为价。多数认为HER-2 +HER-2 +（3 3价）具价）具有临床意义，可以作为使用有临床意义，可以作为使用Hercepti