免疫萃取步骤（一）

1、免疫萃取步骤（一） 一、免疫萃取的普通过程 免疫萃取的普通过程8-4所示它包括四个基本步骤，即免疫亲和柱的平衡、目标化合物的免疫结合、非特异性吸附的冲洗、目标化合物的洗脱。 图8-7 免疫萃取的普通步骤 1免疫亲和柱的平衡 免疫萃取柱在预备用于样品的免疫萃取之前，首先要对之举行预平衡，又叫初始化。初始化的普通办法是依次用5倍柱体积的洗脱缓冲液和同样体积的吸附缓冲液冲洗免疫萃取柱。初始化的目的是除去残留在免疫萃取柱中的可能会对萃取结果造成干扰的化学试剂及其代谢产物。 2目标化合物的免疫结合 初始化完成以后，将样品溶液的ph值调整为中性左右(ph58,由于免疫反应的最适ph值约为中性)，然后通过免

2、疫萃取柱，溶液中的被分析物与抗体结合而被保留在柱中，其他物质大部分随溶液流出。为了解免疫亲和柱中抗体和被分析物结合的最佳酸度条件，需要事先用被分析物的标准溶液来挑选萃取效率最高的最适ph值。此外，在样品的萃取过程中，还要尽量避开非特异性吸附的发生。通常，非特异性吸附是因为样品杂质的疏水性或与免疫吸附剂之间的离子作用造成的。因此，可以通过如下办法削减非特异性吸附的影响： 避开用法高取代的免疫吸附剂。 限制免疫吸附剂的用量，普通足够萃取样品中的目标化合物即可。 使免疫吸附在半解离条件下举行，在此条件下，除抗体和抗原的特异性免疫反应外，其他化合物与抗体的结合应被抑制。 挑选相宜的样品萃取和冲洗缓冲条

3、件(ph值和离子强度)。 3冲洗 冲洗是在免疫萃取柱中加入样品之后，洗脱之前，用整洁的溶液或缓冲液冲洗免疫萃取柱的过程。冲洗的作用一方面是清除免疫吸附剂的空体积；另一方面是除去与免疫吸附剂非特异性结合的基团。 4洗脱 目标化合物被免疫亲和柱挑选性吸附以后，需要用洗脱溶液冲洗亲和柱，使目标化合物与抗体解离，然后被收集或挺直在线进入hplc等分别和检测系统，举行分析测定。洗脱条件的挑选对免疫萃取办法的建立具有重要作用。对洗脱液的要求主要有三点：第一是要能有效地使目标化合物与抗体解离；其次是溶液用量要尽可能少；其次是对抗体活性的伤害尽可能小。下面将对洗脱条件的挑选举行具体介绍。 二、洗脱条件的挑选

4、普通认为，目标化合物与抗体的免疫反应过程是这样的：首先目标化合物和抗体通过静电引力而互相吸引并以特定位置互相逼近；然后形成氢键，并将目标化合物和抗体间的水分子排出，抗原和抗体结合得越发紧密；最后，分子间通过范德华力形成稳定的非共价键，目标化合物被抗体吸附。要将目标化合物解吸下来，必需首先将抗原抗体复合物破坏。因为生化交互作用的能量十分高，因此必需显著地转变试验条件才干使抗原抗体复合物被破坏。目前，将日标化合物解吸的办法主要有两类：一类办法是竞争替换法，即用竞争性试剂如抗体、目标化合物的结构类似物等将目标化合物从抗体上夺取或替换下来；另一类办法是非竞争性办法，即显著提高抗原抗体复合物的解离常数，

5、使目标化合物被解吸。这类办法主要有：用法离液剂，转变缓冲溶液的ph值，降低洗脱液极性，可逆性转变分子结构，上升溶液温度，电泳等。 竞争替换法需要用大量的抗体、替换试剂(抗原类似物或其他交错反应试剂)冲洗免疫亲和柱，才干保证将目标化合物定量替换解吸下来，并且，替换试剂必需符合以下条件：它必需与固定化抗体具有很强的交错反应性；在色谱柱上的保留时光必需与目标化合物有很大差异，否则，由于替换剂的用量十分大，它的峰可能会对目标化合物的峰造成干扰；稳定性强，纯度高，由于低至0.010.1的杂质就会在色谱图上产生杂质峰；价格低廉，毒性低，并且在实际样品中不存在。因为抗体较为昂贵，而符合条件的替换试剂又相对难

6、以找到，所以这种办法只在临床讨论中有所应用，在环境分析中则未见报道。 在溶液中，离液剂的作用是扰乱抗体周围的水环境，从而导致抗体二级结构和目标化合物与抗体之间的疏水作用的破碎，使目标化合物被解吸。离液剂已胜利地用于免疫亲和柱上吸附的蛋白抗原的解吸，所用的浓度普通在1.58mol·l-1。常见阴离子的离液作用强度由强到弱分离为：cc13coo- scn-cf3coo-clo4-i-no3-br-cl-ch3coo-so42-po43-；常见阳离子的离液作用强度由弱到强分离为：nh4+rb+k+na+cs+li+mg2+ca2+ba2+。 在免疫萃取中。降低洗脱液的ph值，使低分子量的目

7、标化合物从免疫亲和柱上解吸下来是常用的办法之一。在不转变离子强度的状况之下，洗脱液的ph值应与抗体蛋白的等电点相差3个ph值单位以上。可用于洗脱的缓冲体系有：甲酸(ph2.5)、(0.010.1mol·l-1)、-盐酸缓冲液(0.010.1mol·l-1；ph 1.53)、柠檬酸(0.1 mol·l-1)。通过降低洗脱液ph值使免疫复合物解吸可以削减对抗体可变区的伤害，但是假如酸度过低也有可能使抗体发生形变：用法这种办法举行洗脱所带来的一个问题是洗脱液的用量比较大，在离线萃取时洗脱完成后还需要一个相对照较困难的水溶液蒸发浓缩的过程。这会增强试验的劳动强度，并影响结

8、果的重临性。在在线萃取中，这种缺陷可以通过在免疫亲和柱的后面加一个捕集柱(trapping column)的方式克服。图8-8是这一办法的暗示图，第1步，将六通阀1和2置于“load”位置，用吸附缓冲液(0.1 mol·l-1缓冲液，ph7.0)平衡免疫亲和柱，用色谱缓冲液(甲醇-水，80:20)平衡捕集柱和色谱分别柱；第2步，将六通阀1置于“inject”位置，样品溶液通过免疫萃取柱，分析物与抗体结合；第3步是将六通阀1置于“load"位置六通阀2置于“inject”位置，使洗脱缓冲液(0.05mol·l-1缓冲液，ph 2.5)通过免疫萃取柱将分析物洗脱并送入

9、捕集柱，使分析物被吸附；最后一步是将六通阀2置于“load"位置，色谱缓冲液通过捕集柱使分析物解吸附并在分别柱上被分别。通过转变缓冲液ph值将分析物洗脱的办法有两个优点：第一，免疫亲和柱可以做得比较大，并且样品的加入速度可以比较高；其次，因为流过免疫亲和柱的溶液所有为水溶液，所以有利于削减洗脱过程对固定化抗体的伤害，延伸免疫亲和柱的用法寿命。 图8-8 免疫亲和柱一捕集柱在线免疫萃取系统暗示图 另外一个常用的洗脱办法是利用水一有机溶剂混合体系对目标化合物举行解吸。有时，在用法有机溶剂的同时还采纳降低ph值或者ph值梯度洗脱的办法以提高洗脱的效率。有机溶剂洗脱的原理是溶液中的有机溶剂可以破坏抗原抗体复合物的疏水性结合部分，使抗原解吸。这种办法的优点是：洗脱液用量少，洗脱时光短；洗脱液可以作为hplc等分别仪器的流淌相，挺直进入色谱柱举行检测；洗脱液中有机溶剂含量越高，则蒸发浓缩越便利，一可用干目标化合物的离线萃取。事实上，在许多离线萃取过程中，包括一些已经商品化的免疫萃取柱中所用法