免疫萃取步骤（二）

1、免疫萃取步骤（二） 三、离线免疫萃取 离线免疫萃取(off-line immunoextraction)是相对照较简单与hplc、gc、ce、elisa等分析手段实现联用的一种免疫萃取方式。其基本操作步骤是首先将样品通过免疫亲和柱，使分析物被抗体捕捉；然后用一定体积的吸附缓冲液冲洗免疫亲和柱，将柱中未与抗体结合的杂质洗出；接着用洗脱缓冲液将分析物从免疫亲和柱上洗脱下来，将洗脱液蒸干，用另一种溶剂将分析物重新溶解、定容或衍生，最后将分析物溶液引入分析仪器举行分析测定。因为离线免疫萃取对固相载体的耐压性要求不高，所以可以选用的固相载体材料十分广泛。尤其是可以用法一些比较频繁的商品化活化载体材料，如

2、cnbr-sepharose、protein a-sepharose等对抗体举行固定化，从而使抗体的固定化更简单实现。在免疫亲和柱与气相色谱的联用中，离线免疫萃取方式应用最多。这主要是由于洗脱液往往含有水等强极性溶剂，尤法挺直进入gc。另外，对于难挥发或热稳定性比较差的分析物在进入gc之前还需要举行衍生化处理。 在与hplc的联用中，因为离线免疫萃取方式在挑选洗脱缓冲液时不需要考虑其是否与色谱分别柱相匹配，所以可以挑选最为抱负的洗脱方式，以提高对分析物的回收率，或延伸免疫亲和柱的用法寿命。 离线免疫萃取的优点是简单与多种分析手段联用，对柱填料的要求不高，免疫亲和柱的制备相对照较简单；缺点是自动

3、化程度低，费时、费劲，测量的精密度也不高，而且因为不行能将定容后的溶液所有注入分析仪器，所以检测敏捷度也有一定程度的降低。 四、在线免疫萃取 提高分析过程的自动化程度是分析化学家追求的目标之一。将免疫亲和萃取及净化过程与分析检测过程实现在线衔接(即在线免疫萃取，on-line immuno-extraction)不仅仅是提高自动化程度的间题，它还有助于提高分析办法的重复性和降低检测限。因为目前在环境分析中主要依赖gc和hplc以及ms对样品举行分别、定性和定量，所以到目前为止，大多数讨论集中在免疫亲和柱(iac)与gc-hplc的联用技术。 iac与hplc的联用有两种主要方式。相对照较容易的

4、一种方式是将免疫亲和柱与色谱分析柱挺直联用，基本衔接方式8-9所示。因为免疫亲和柱要承受比较高的压力，所以固定化抗体用的载体材料必需是耐压的硅土、多孔玻璃等。比如pichon等用以硅胶为载体材料的免疫亲和小柱挺直与c18分析柱在线联用，对三嗪类和苯基脲类除草剂举行了免疫萃取与测定比州。首先样品通过iac，分析物与抗体结合，其他组分随麦液排出；然后将阀切换，使iac与分析柱挺直衔接，水-乙腈混合溶液以一定梯度流过iac，将抗体洗脱下来，并进入分析柱举行进一步分别。为庇护免疫亲和柱，当的浓度大于50时，将阀切换，使溶液不经过iac而挺直进入分析柱，避开固定化抗体因长久裸露于有机相中而变性。免疫亲和

5、柱先后经5ml 70和6ml pbs缓冲液复原后可举行下一次萃取。对于比较脏的样品，免疫亲和柱可以反复用法5。次左右。在一些讨论中，洗脱出的分析物还可以在反相柱的顶端进一步浓缩，然后通过梯度提高流淌相中有机溶剂的比例，使分析物在反相柱中得到分别。 图8-9 iac- h plc联用装置暗示图 另外一种相对照较复杂的方式是免疫亲和柱-反相色谱预柱/捕集小柱-分析柱联用方式，系统基本结构8-8所示。因为捕集柱还可以对iac洗脱出的组分起到浓缩富集的作用，所以免疫亲和柱的柱体积可以比较大，这样可以提高单位时光内的样品通量并提高检测敏捷度。另外，它还有助于降低因为柱切换而造成的背景峰。因为洗脱溶液不进

6、入色谱分析柱，所以可以灵便多样地挑选洗脱缓冲液，以提高分析效率，延伸免疫亲和柱的用法寿命。以琼脂糖为载体材料的免疫亲和柱因为不能耐高压，所以在在线免疫萃取中主要以这种方式与hplc实现联用。 免疫亲和萃取和hplc的在线联用现在讨论得无数，其中一个主要缘由是它可以显著降低样品中难分别基质对分析物的干扰，这样，利用常规的紫外检测器，就可以得到比较高的检测敏捷度。例如，除草剂阿特拉津在土壤中有两种主要的代谢产物：脱乙基-阿特拉津(dea)和羟基-阿特拉津(oha)，利用常规的反相hplc柱只能得到土壤提取液中阿特拉津和dea的峰，oha的峰受样品基质的干扰很难辨认。而同样的土壤提取液经过阿特拉津免

7、疫亲和柱后，样品基质的影响被显著消退，在色谱图上获得了显然的3种分析物的峰。另外，因为hplc具有十分精密的泵和注射系统，所以免疫亲和萃取和hplc的在线联用也可以提高分析的精密度。 因为gc具有很强的分别能力和可以选配多种敏捷的检测器，所以gc是分析多种低沸点化合物的首选。将gc与iac结合，可以显著降低样品基质对分析的影响，降低gc的检测限。gc与iac的离线联用已有多篇报道，但是关于iac与gc在线联用的报道尚不多见。这可能主要是由于iac的洗脱溶液通常是水溶液或水-有机混合溶液，不适合挺直进入气相色谱柱，必需要经过一个溶液转换步骤将水除去，而这一过程普通比较复杂。常用的iac与gc联用系统的基本衔接方式8-10所示，从免疫亲和柱洗脱下来的分析物首先通过一个反相色谱预柱。在这里，反相色谱预