质粒DNA的提取实验

1、实验六 质粒DNA的提取一、实验目的通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒二、实验原理质粒 (Plasmid) 是独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子。它是一种环状的双链DNA分子，存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中， 在细菌细胞中最多。本实验利用SDS碱裂解法提取质粒 DNA将细菌悬浮液暴露于高 pH值的强阴离子洗涤 剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒 DNA释放到上清中。在裂解过程 中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，后者被 SDS(十二烷基硫酸钠)包盖。当用K+取代Na+时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离

2、心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。三、实验材料与试剂1、 实验材料 大肠杆菌(含有携带插入片段的质粒PMD-18T)2、实验试剂(1) 溶液I: Tri s HCI(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖 50mmol/L ;(2) 溶液 n (新鲜配制):NaOH 0.2mol/L,SDS 1%(W/V);(3) 溶液川(100ml) : 5mol/L 乙酸钾 60ml,冰乙酸 11.5ml(pH4.8), 水 28.5ml ;(4) 氯仿异戊醇( 24: 1)；(5) 异丙醇、 70%乙醇；四、实验步骤(一)提取质粒1. 挑转化后的单

3、菌落(含PMD-18T质粒)，接种到20ml含有适当抗生素(Amp)的丰富培养基 中(LB培养液)，于37C剧烈振摇下培养过夜。(由老师完成)2. 将1.5ml的培养物倒入 1.5ml的EP管中，于 4 C以12000rpm离心1min。3. 离心结束，弃去上层培养液，再向离心管中加入1.5ml的培养物，于4 C以12000rpm离心 1min。4. 弃去上层培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。5将细菌沉淀重悬于100卩l冰预冷的溶液I中，用Tip吸头吹打沉淀至完全混匀(无块状悬 浮) 。6. 加200卩I新配制的溶液n于每管细菌悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管5次,以混合内容物 , 注意动作一定要

4、轻柔缓和，切勿振荡 ! 将离心管放置于冰上 (2min) 。7. 加150卩I用冰预冷的溶液III,盖紧管口，反复颠倒数次，使溶液川在粘稠的细菌裂解物 中分散均匀，之后将管置于冰上 35min。8. 4 C以12000rpm离心5 min,将上清液(400卩I )转移到另一离心管中。9. 加等体积的氯仿：异戊醇(24： 1)振荡混匀。4 C以12000rpm离心5min，将上清液(300卩I )转移到另一离心管中。10. 加2/3体积的异丙醇沉淀质粒DNA振荡混匀，于冰上放置15min。11.4 C以12000rpm离心5min。小心吸去上清液，将离心管倒置于纸巾上，以使所有液体 流出。再将附

5、于管壁的液滴除尽。12. 加1ml 70 %乙醇溶液洗涤沉淀，振荡混匀，4 C 12000rpm离心5min。弃去上清液，在空气中使DNA沉淀干燥(约5-10分钟)。13. 用20卩l灭菌的蒸馏水溶解 DNA力口 1卩l胰RNA酶37 C消化RNA 30min。14. 用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测质粒的提取状况。五、实验结果我组为第 7组， 由电泳图谱可以看出，电泳得到 3个条带，条带较为清晰。 最前面的一条带为超螺旋的质粒 DNA(分子量2000bp),中间的条带为两条链均发生断裂而形成的线形DNA最慢的条带为一条链发生断裂的开环质粒DNA六、思考题1. 试述在提取质粒过程中溶液I 、II

6、、III 的作用是什么 ?(1) 溶液I: Tris HCI(pH8.0)25mmol/L,EDTA(pH8.0)10mmol/L,葡萄糖 50mmol/L ;主要作用是使细菌悬浮，此外EDTA可抑制DNase的活性。(2) 溶液 n (新鲜配制):NaOH 0.2moI/L,SDS 1%(W/V);碱会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA排放到上清中；在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，可被SDS(3) 溶液川(100ml) : 5moI/L 乙酸钾 60ml,冰乙酸 11.5mI(pH4.8), 水 28.5ml ;Kf置换了 SDS中的Nsf,得到PDS(十二烷基磺酸钾)，这些复合物可以从溶液中有效地沉淀下来，经离心除去。2. 描述质粒DNA的电泳图谱，并解释产生的现象及可能的原因?实验中得到的质粒 DNA电泳图谱显示共有三条带，其中：最快的一条带是超螺旋的质