国外全自动沙眼衣原体及淋球菌核酸双检技术新进展

1、国外全自动沙眼衣原体及淋球菌核酸双检技术新进展沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis , CT)和淋球菌(Neisseria gonorrhoeae, NG )是全球最主要的性传播疾病的病原体。美国CDC推荐16-25岁的年轻女性每年进行 CT的筛查。我国从2008年已经开始对CT感染进行单独报病，而 NG是我国法定上报的传染病。 CT 和NG的共感染现象非常普遍，因此研发的诊断技术平台也通常是检测两种病原体。最先发展起来的 CT和NG核酸检测技术是直接检测核酸技术( NAH :包括Gen-probe 公司的PACE2 PACE2C和Digene公司的杂交捕获 HC2但是NAH

2、的方法其敏感性远不如核 酸扩增技术。 随着核酸扩增技术的出现， 这类方法逐步被取替而失去其应用价值。 截止目前 为止，美国FDA批准共五家公司的商品化试剂用于检测泌尿生殖道的CT和NG感染检测，分别是罗氏的 Amplicor CT/NG 、 Cobas 4800 ，雅培公司的 Real Time CT/NG ， Gen-probe 的 APTIMA Combo2( AC2) ， Becton Dikinson (BD)公司的 Probe Tec ET CT/GC Probe Tec ET CTQx/GCQx 和 Cepheid 公司的 GeneXpert CT/NG。罗氏公司Amplicor

3、CT/NG 产品用于检测 CT的靶目标基因位于 CT隐蔽的质粒基因上， 而用于检测NG的靶目标基因则是 DNA胞嘧啶甲基转移酶基因，扩增后的产物检测则基于生 物素-亲和素的交互作用利用 ELISA的方法进行。该方法由于不能够检测出瑞典瑞典的CT新变种，现在该公司已出新的产品Cobas 4800 CT/NG以取代该产品。Cobas 4800 CT/NG检测试剂盒在全自动的平台基础上完成实时定量PCR勺检测全部步骤。该试剂利用两个靶基因检测CT, 一个位于隐蔽质粒上，另外一个靶基因位于编码主要外膜蛋白的ompA可以保证能够检测瑞典的 CT新变种2。而用于检测 NG的靶基因则分别位于正向重复序列9

4、(DR9及其DR9突变区上。该产品通过全自动化的处理，可有效的预防实验过程中的人为污染，可在 8小时内完成高达 278份的样本量。 目前该产品可应用于阴道拭子， 宫颈拭子、 尿液等标 本。而该产品应用于液基细胞学还在评估当中。研究者利用已上市的Gen-probe的AC2和Becton Dikinson 公司的 Probetec ET CTQx/GCQx 的产品作为参评试剂，多中心评价 Roche 的 Cobas 4800 CT/NG 产品的性能，以患者的患病状态作为诊断的标准，该产品的敏感性和 特异性的结果见表一。图一：罗氏的 Cobas 4800检测系统表一：罗氏的 Cobas 4800检测

5、CT和NG的临床特性样本敏感性C4800对照试剂特异性C4800对照试剂参考文 献量样本类型AC2CTQAC2GCQCT4316宫颈拭子91.696.695.199.899.299.714316女性尿液92.395.894.899.899.599.814248阴道拭子92.9NDND99.7NDND2768男性尿液97.696.898.499.598.999.23NG4316宫颈拭子95.610094.310010099.814316女性尿液98.596.9979799.999.914248阴道拭子98.5NDND100NDND2768男性尿液10010010099.710099.73C480

6、0,罗氏的 Cobas 4800; AC2 Gen-probe 的 APTIMA Combo2; CTQ GCQ 为 BD公 司的Probetec ET CTQx/GCQx ; ND文献中没有提及该数据。雅培公司Real Time CT/NG产品依赖于 m2000全自动系统。该产品目前也包含了CT的两个靶基因，其中一个位于隐蔽质粒上，另一对引物同样是为了保证能够检测瑞典的CT新变种而选用的ompA基因的一段保守序列；而用于检测NG的引物位于Opa基因上。该产品所用对照是在DNA提取步骤中加入的， 可以用以评价提取的效率和潜在的PCR抑制。该系统可以在8小时内一次处理 96个样品，检测186个样

7、品。Gaydos CA等通过多中心的临床试验 评估了雅培公司的 Real Time CT/NG产品，研究中共采集 16个地区共3832例患者的标本， 选用已上市的 Gen-probe的AC2和 Becton Dikinson 公司的Probetec ET CT/GC的产品作为 参评试剂，以患者的患病状态作为诊断标准，研究发现RealTime CT/NG产品检测CT的敏感性和特异性分别为 92.4%和 99.2%, NG的敏感性和特异性分别为96.9%和 99.7%。图二：雅培的 m2000检测系统Gen-probe公司生产的AC2是利用转录扩增特异性的靶 rRNA序列，旨在减少或消除扩 增抑制

8、，通过磁珠法提取核苷酸，然后转录扩增CT的23S rRNA和NG的16S rRNA，将扩增产物与标记的寡核苷酸探针杂交，通过化学发光反应进行检测。扩增的过程恒温，操作较简便。该产品可在 TIGRIS系统上实现自动化（见图三），可在 8小时内检测多达500份的样 品。为了获得更高的特异性，厂家建议对阳性的标本进行CT的16S rRNA和NG的16S rRNA（另外一个序列）进行再检测。该产品和BD公司的产品已是较为老牌的上市产品，新的产品上市前的试剂评估通常选用这两家的产品，其检测敏感性和特异性在前文已经有表述，在此不再赘述。图三：Gen-probe公司的TIGRIS系统BD公司生产的Probe

9、tec ET是美国FDA第一个批准的实时定量检测这两类病原体的产品。该技术以等温（温度为 52.5 C）链置换扩增（SDA技术为基础。该产品选用CT的隐蔽质粒和NG的菌毛反相蛋白同系物（PivNg）序列为靶目标基因，利用荧光探针检测扩增后产物。 该产品利用扩增后的产物不暴露在环境中以尽可能减少潜在的环境污染，但是无法降低在扩增前携带进去的污染。BD公司目前已经研发了新一代的产品CTQx/GCQx可在Viper系统实现自动化（见图四）。使用BDViper系统（采用XTR技术）进行测试时，BDProbeTec CT Qx/GC Qx DNA扩增检验会利用 BD的专利氧化铁、FOX? Extract

10、ion和链转移扩增技术对 CT和NGCT和NG该产品在8进行直接定性检验。该系统利用双化学扩增检测系统可同时用来检测 小时工作时间内可分析 278个样品。XTR图四：BD公司的Viper系统Cepheid Gen eXpert CT/NG 是最近刚被FDA批准的体外定量检测 CT和NG的分子诊断 技术，该技术首次使同时感染 CT/NG两种病原体的患者可在同一天内得到诊断和治疗。该试剂选用NG基因组染色体DNA上两个相对保守且不相连的基因作为检测NG的靶基因，选用CT染色体基因作为 CT的靶基因，并选用细胞看家基因作为样品对照基因，该对照基因不要 求完整的细胞只需要有样本含有DNA即可。该产品是

11、通过模块筒为基础的平台对子宫颈拭子、阴道拭子和尿液标本的DNA进行基因组DNA的纯化、浓缩、检测和并利用硅法暴露多重基因靶标，然后进行实时定量PCR勺方法进行检测，可在 2小时之内对1-96个标本进行处理分析，可以最大程度的减少处理的步骤和污染的可能。该全自动系统可将样品准备、定量PCR扩增及荧光检测集于一体并自动进行核酸检测分析。Gaydos CA等通过多中心的临床试验评估了 Cepheid公司的Gen eXpert CT/NG 产品，研究中共招募 1722例女性患者和1387 例男性患者，选用已上市的Gen-probe的AC2和BD公司的Probetec ET CT/GC 的产品作为参评试

12、剂，以患者的患病状态作为诊断标准，结果显示女性宫颈拭子、阴道拭子及尿液检测CT的敏感性分别为 97.4%, 98.7%和 97.6%,男性尿液检测的敏感性为97.5%,所有标本检测的特异性均高于99.4%;而女性宫颈拭子、阴道拭子及尿液检测 NG的敏感性分别为100.0%, 100.0%及95.6%，男性尿液检测的敏感性为98.0%，所有标本检测的特异性均高于99.8%14。而该产品应用于眼部检测CT也具有良好的敏感性和特异性。图五：Cepheid公司的全自动系统目前所有FDA批准的商业化核酸检测产品都仅限用于泌尿生殖道标本的临床诊断， 其敏感性和特异性都比较好，其中Gen probe是检测RNA其余均是DNA佥测。全自动化的系统中，罗氏和雅培的核酸提取和实时定量检测是在不同的仪器中完成的。其中Gen probe和BD公司是等温的扩增系统，但有样本量检测的限制。而Cepheid是目前唯一没有样本量限制的，可自由实现 1-96个标本的检测。生殖道外的标本如直肠和咽部拭子还未被批准，但是越来越多的证据显示核酸扩增的检测技术在这些部位的敏感性要高于培养。其中主要的原因在于NG核酸检测的特异性一直遭受