WB实验基本步骤

1、实验基本步骤提取细胞蛋白BCA定量制备蛋白胶（SDS-PAGE交）蛋白样品变性电泳转膜封闭一抗TBST洗涤TBST洗涤显影结果分析试剂配制1.PBS磷酸盐缓冲溶液 1L磷酸二氢钾0.24g磷酸氢二钠1.44g氯化钠8g氯化钾0.2g加入 500ml 纯水，调 PH=7.2定容至 1L, 高压蒸汽灭菌2. PBST （ PBS+0.05% 吐温 -20）500mlPBS+0.25ml 吐温 -203. 电转液 500mlTris 1.5g甘氨酸 7.2g 400ml 水溶解 加入100ml甲醇，置于4 C冰箱预冷4. 电泳液（ 1X ）10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水5. TBS

2、6. TBST （TBS+0.05% 吐温 -20）50mlTBS+450ml 纯水 +0.25ml 吐温 -207. 封闭液TBST1X+5% 奶粉40ml封闭液=40mlTBST+2g 奶粉，40 C预热WB 实验、蛋白样品制备准备:一管细胞，PBS( 4C预冷)，PMSF (lOOmM )，移液枪(1000ul, 10ul), 1.5mlEP管2个，高速冷冻离心机4 C预冷1. 于-20 C冰箱中取出一管细胞样品，吸去培养液2.加入1ml 4 C预冷的P BS (0.01M pH 7.27.3)。用移液枪轻轻吹成悬浮液后4C, 8000r离心5min，然后弃去上清。重复以上操作一次，共洗

3、细胞两次以洗去培养液。(PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。)3.按1ml裂解液加10卩l PMSF( 100 mM),摇匀置于冰上。4. 在样品中加入300ul含PMSF的裂解液，吹匀，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5.裂解完后，于 4 C下12000 rpm离心5 min。蛋白含量的测定（BCA定量）准备：96 孔板，移液枪（lOOOul, 10ul, 200ul）, BCA工作液（A+B）, 50mlEP管，IxPBS BSA标准液 1.将96孔板分好区域，若不够分则只做两个重复，（外围一圈的孔最好不用） 2.算好孔数（总的）每孔加200UIBCA工

4、作液（A+B），（ A液：B液=50:1，一般配多些，如60孔，A液12000ul，B 液 240ul)3.将样品稀释到一定倍数才能定量，（10倍，20倍，30倍），每孔需要20ul样品（2ul样品+18ulPBS即稀释10倍），做三个重复则需要60ul，一般配80ul4.配蛋白标准样品，将2mg/ml的蛋白标准溶液稀释至0.5mg/ml，若配200ul的0.5mg/ml蛋白标准溶液则需要50ul的2mg/ml的蛋白标准溶液和150ul PBS溶液0, 1,2,4,8,12,16,20加到标号的区域，之后5. 将稀释好的样品加入孔板中（标记的区域），接着标准品按在加标准样品的孔内，将孔内溶液用

5、PBS补足到20ul6. 每孔加200ul配好的工作液，平行加，不能上下加，以减少误差 7.将加好的96孔板放在37 C下孵育30分钟8.孵育完后，放在酶标仪轻微震荡3-10S，中速，吸光值595nm,进行比色测定，记录标准曲线及样品吸光值数据后以蛋白含量（ml）为横坐标，吸光值为纵坐标作标准曲线。（R2 >0.98才有用，酶标仪操作：两个箭头图标,1是结果,2是保存）9.计算蛋白含量（注意定量样品已经稀释了10倍）蛋白质定量标准曲线加样量序号标准蛋白量/ul12(0.5mg/ml )1620背景液（PBS /ul 2019181612标准液浓度mg/ml 00.0250.050.10.

6、20.30.40.5SDS- PAGE电泳1.配胶（12%,可以提前配好）准备：玻璃板，梳子， AP （解冻，现拿现用），聚丙烯酰胺（4 C冰箱冷藏）(1)玻璃板验漏5min按表配置分离胶灌胶，加酒精封压，凝 30min （注意不要有气泡）按表配浓缩胶，倒掉酒精，用吸水纸吸去酒精，灌胶，插梳子（注意不要有气泡），凝30min取胶，用水冲洗一下浓缩胶，加少量水放入一次性手套中4C冰箱保存备用2.样品处理准备：PBS移液枪，1.5mlEP管（1）稀释样品：一般每孔上样5ul，即1mg/ml浓度的样品，测完蛋白含量后，将样品用PBS稀释至1mg/ml（注意loadingbuffer的加入也得算入）（

7、2）取出上样样品15ul至1.5 ml离心管中，加入6 X SDS上样缓冲液3ul至终浓度为1 x°（上样总体积般不超过15卩l，加样孔的最大限度可加 20卩l样品。）（3）将样品在100C煮5 min震荡使蛋白完全变性（注意仪器操作）3. 电泳准备：电泳液500ml （现配），蛋白胶，10ul移液枪（枪头），样品，Marker，冰盒，电泳装置（1 ）将SDS-PAGE交放入电泳槽中，加足够的电泳液。（短玻璃板面向内，长玻璃板面向外。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。电泳液至少要漫过内测的短玻璃板。注意先检漏。）（2）上样。用移液枪贴壁吸取样品， 将样品吸出不

8、要吸进气泡。 将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳 缓冲液中洗涤 3 次，以免交叉污染。）（3）先设置80V,开始电泳，样品溴酚蓝跑至分离胶后增至120V电压，电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。（此时准备好电转液）四、转膜准备：电转液（现配 4 C冰箱冷藏），镊子，滤纸， PVDF膜（ 0.45um ），电转装置，冰盒 注意：拿滤纸和膜时一定要戴手套或用镊子，因为手上的蛋白会污染膜。1. 在加有转移液的盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫2. 滤纸浸入电转液中，PVDF膜在甲醇中润湿成半透明，小心将

9、膜放入4C电转液中平衡至少 5min。3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。（一 手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。4. 先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松 动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影3 张滤响操作），要避免把分离胶刮破。小心剥下分离胶盖于滤纸上（做好标记），用手调整使其与滤纸对齐， 轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个

10、胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖 纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去 气泡。膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开 门以使空气流通。）5. 将夹子放入转移槽中（电转移时会产热，浆槽放入冰中），要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的 红面。一般用 100mA 转移 90min。6. 转完后将膜用1 X丽春红染液染 5 min （于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上 的蛋白。将膜晾干备用。（准备封闭液）六、免疫反应2h。准备：封闭液，一抗，二抗，TBST 1.将膜移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭 2. TBST洗4次。每次5分钟。2h或者4C过夜3. 将膜按照目的蛋白所处位置剪切并做好标记，加入相对应的一抗，室温孵育4.室温下孵育12 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗四次，每次5min5.同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育12 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗 4次，每次 5 min七、显影准备：样品胶片，移液枪（200UI），中枪头，吸水纸，显影液（A+B）,薄镊子一抗一抗目的蛋白78kd 1；ip 1:1000兔二抗75kd目的蛋白34kd G5APDH内 参 1:5000鼠二抗