高通量测序(NGS)数据分析中的质控

1、高通量测序错误总结亠、生信分析部分1) Q20/Q30opkergeneMM每个位点的碱基质量(Per base sequence quality)碱基质量分数与错误率是衡量测序质量的重要指标，质量值越高代表碱基被测错的概率越小。Q30代表碱基的正确判别率是 99.9%，错误率为0.1%。同时我们也可以 理解为1000个碱基里有1个碱基是错误的。Q20代表该位点碱基的正确判别率是 99%， 错误率为1%。对于整个数据来说，我们可以认为 100个碱基里可能有一个是错误的, 在碱基质量模块报告的坐标图中，背景颜色沿y-轴将坐标图分为3个区：最上面的绿色是碱基质量很好的区，Q值在30以上。中间的橘色

2、是碱基质量在一些分析中可以接受的区，Q值在20-30之间。最下面红色的是碱基质量很差的区。在一些生信分析中，比如以检查差异表达为目的的 RNA-seq分析，一般要求碱基质量在 Q在Q20以上就 可以了。但以检查变异为目的的数据分析中，一般要求碱基质量要在Q30以上。一般来说，测序质量分数的分布有两个特点：1测序质量分数会随着测序循环的进行而降低。2有时每条序列前几个碱基的位置测序错误率较高，质量值相对较低。Q30在图中这个例子里，左边的数据碱基质量很好，而右边的数据碱基质量就比较差，需要 做剪切(trimming )，根据生信分析的目的不同，要将质量低于 Q20或者低于 的碱基剪切掉。2）序列

3、的平均质量序列的平均质量（per sequence quality卄睚score)MHam1 1AM- m * 一 IHi i -nvsH豪煙魅I/111111 illI | AwM W Ji ifcf d !FHP0- 3 严创丁；t i # 4 血 N|i 出 pif 打 ji 鼻事鼻和呵血越肉m这个是碱基序列平均质量报告图。横坐标为序列平均碱基质量值，纵坐标代表序列数量。通过序列的平均质量报告，我们可以查看是否存在整条序列所有的碱基质量都普 遍过低的情况。一般来说，当绝大部分碱基序列的平均质量值的峰值大于30 ,可以判断序列质量较好。如这里左边的图，我们可以判断样品里没有显著数量的低质量

4、序列。但如果曲线如右边的图所示， 在质量较低的坐标位置出现另外一个或者多个峰，说明测 序数据中有一部分序列质量较差，需要过滤掉。3) GC含量分布GC含量分布(per sequence GC conte确:常护健*IH糾扛，Blue： Thrortical Hed: CK counl per rdNat自珂玄呼列.帝鉴孔这个是GC含量分布报告图。GC含量分布检查是检测每一条序列的 GC含量。将样品序列的GC含量和理论的GC含量分布图进行比较，用来检测样品数据是否有污染等问题。理论上，GC含量大致是正态分布，正态分布曲线的峰值对应基因组的GC含量。如果样品的GC含量分布图不是正态分布，如右图出现

5、两个或者多个峰值，表明测 序数据里可能有其他来源的 DNA序列污染，或者有接头序列的二聚体污染。这种情况下，需要进一步确认这些污染序列的来源，然后将污染清除。4）序列碱基含量序列碱基含量(per base sequence content)席心用碱基含量模块是统计在序列中的每一个位置，四种不同碱基占总碱基数的比例。它的目的是检测有无 AT、GC分离的现象，而这种现象可能是测序或建库的系统误差所带 来的，并且会影响后续的生信分析。理论上，在随机的DNA文库中，G和C含量以及A和T含量在每个测序循环上应分别相等，而且整个测序过程稳定不变。 所以碱基含量的四条线应该是基本平行的水平线（图A）。而现实

6、中，由于建库 PCR扩增时PCR引物的最初几个碱基不能很好地和模板DNA结合，常常会导致测序结果序列开始的大约前10个碱基位置，碱基含量有较大的波动。这种波动存属于技术误差（图 B）。如果在 整个测序过程中，四条碱基含量线都出现波动，可能是样品库里有过多的接头序列的二 聚体（图C，D）。在建库过程中，如果加入的接头序列过量，两个接头序列可能会连在 一起，中间没有要测序的插入序列，形成接头序列二聚体。这些二聚体可以利用 adapter trimmer 软件去除。5) 过量出现的序列x CIPHER GENE7 VflV-H过量出现的序列( FJMIill. MW *4. HI rl EW C9

7、Pla ethiaMrW, WTTMfMK.HaKiflMM.m?g HIM I. n* 11*1 U1 HIM ll-H M Hi nt W fCt It ft* I UM pw iWlLNM 1.*1731* 订hM IlM KV tf 软 El t gnBMPMIMMIHMiMMMMiMlMMMMm hhhivHiiiiMMHieWlakMMmHiCBHPm Ih班側.r町f.HFiiwm ffRriff, wr t,iNi.vQfriMMtT 门密 n 2i n hM i hw* ntfiC.ljmiMJW4!lr| (14*4EM V& It IM JW M|! II l-lth h

8、ltiJMf I* li i.*mM FfeatBd MIhl iJBi | M4 -rfM b-llgIE；.&dHHdMW nhuH)心wmiWIi . 3|tl.:MiTidJrniA2Jih-VUiiM f feMbitjj jMMw# 1 fc vni WVf11 M i-MfPTPvLmJII l4lPI-M41fc| I过量序列模块是查看数据是否有污染的另一种方法。如果某个序列的数量占全部序列的0.1% 以上，FASTQC 就定义该序列为 over-represented。这些 over-represented 序列通常标示着污染序列的存在。这种污染如果是建库测序中的接头序列，f

9、astqc可以检测并标示出可能的来源(possible source )。但如果污染是由于其他来源的DNA，比如其他生物的DNA，FASTQC就没法判断污染序列的来源。这就需要生信分析人员利 用其他方法找出污染源。比如将大量出现的序列和 NCBI的DNA数据库进行blast，看看污染序列是否来自其他物种。6）过量出现的 KmerCIPKEH GEMEW*S0l过量出现的k-mer (k-mer content)Need to be trimimeci检查是否有接头序列，还可以查看k-mer含量。如果有些k-mer过量出现，很有可能有序列污染。过量出现的 k-mer可能会有三种情况：序列5 端，

10、序列中间，或者序 列3 端。5端过量出现的k-mer是建库PCR扩增时PCR引物无法和DNA模板 很好地结合导致的，是技术误差。出现在中间的k-mer比较少见，可能是接头序列拼7）接头序列含量接头序列含量(adapter content)寸*tapWf CwiMlCi对接头序列污染的查看还有一个更直观的模块,就是接头序列含量。这里的两个例子中,左图没有显著的接头序列污染，右图的接头序列污染就比较显著原始数据有效清理结果f CFHER GENET 自8）去除 duplication 序列去除重复序列Q3rgeme柬沥：PCR扩增的不均一肩果：造成等位雀阖频率的运义及萇冈型识別不准确占除原理；将所有比对到完全相同位置的用列对减少至一对常用软件：picar-tools MarkDuplicate重复序列是怎么来的呢？ 在全基因组或全外显子组测序的建库过程中，需要进行多轮的PCR扩增。由于扩增引物和不同模板结合力的差异， 有些地方的序列扩增产物大于 1 楼正方法:利用机醤学习的 方法建立误差蟆型，然后根 据建立的模生调整碱基质量