三基因工程的基本条件-基因载体精

1、 Genetic Engineering * i基因工程概逑-2.基因工程的基础知识与基本技术4.基因工程的5目的基因的获取”X 6克隆基賢睡二7转基因胡虫Q,基因工程的基本条件B用于基因克隆的载体载体的功能及特征质粒(plasmid)噬菌体载体奄斯质粒切硕妲)与噬菌粒人造染色体载体载体的功能及特征!载体（Vectors ）在基因工程操作中，把能携带外源DNA进 入受体细胞，并在其中得以维持的DNA分 子叫载体。2基因工程对载体的要求（1）具有对受体细胞的可转移性，并在宿主细胞 内能独立复制。（2）有选择性标记，便于重组DNA分子的检测。（3）有一段多克隆位点。外源DNA插入其中不影响载体的复

2、制。（4）分子量小，拷贝数多。（5）容易从宿主细胞中分离纯化。二质粒载体0-小匚"y 二>.八.-：，> 4；-八'AY#大肠杆菌的质粒1. 质粒的一般生物学特性(1)分子小:1500 kb(2) 编码基因少:3个中等大小的蛋白质。如抗菌素抗性、代谢特征等，赋予细菌 一些额外的特性(非必须)。(3)环形DNA分子:双链环状DNA。(酵母的“杀伤质粒"是(4) 质粒的空间构型: 共价闭合环状DNA (cccDNA) Covalent close circular DNA呈超螺旋(SC)(SUper coil)orRight-handed sprre)Lef

3、t4iended superhGlix 开环DNA ( open circular, ocDNA)一条链上有一至数个缺口。 线形DNA ( linear , IDNA)SOOOOdOOOOOOOOOOOOQdQeOQOOOOOOOOOCOOCCOeCOC(5) 质粒空间构型与电泳速率同一质粒尽管分子量相同，不同的构 型电泳迁移率不同：scDNA最快、1DNA次之、ocDNA最慢。OCLSC2. 质粒的类型根据质粒自身传递的性质分为:接合型质粒：能自我转移非接合型质粒不能自我转移大肠杆菌接合(conjunction)5yIbSUHlsIb心'r沦 二n 'F池 .恳耳二;:、J

4、rAH忌必W冷角化厂血-込灼"S戒1供' '*" ? .» 护2i非接合型质粒:虽然带有自我复制所必需的遗传信息，但失 去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因， 因此不能从一个细胞转移到另一个细胞。符合基因工程的安全要求。(1) R质粒(抗性质粒):带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获 得同样的抗生素抗性性状(resistance)。HgR(2) Col质粒:带有控制大肠杆菌素（colicin）合 成的基因。大肠杆菌素对不带Col质粒的大肠杆菌有毒。Col质粒或R质粒如果带有转移基因, 也可以成为接合型质粒。根据质粒的复制特性分为:严紧型质粒(st

5、ringent plsrimid )松弛型质粒（relaxed plasmid）拷贝数多，有1060份拷贝。（非接合型质粒分子量小，一般属松弛型）。根据可否引起宿主出现新形状分为:显性质粒(dominant plasmid)携带其他基因，使宿主细胞呈现新的性状，如 抗性质粒R等隐蔽质粒(concealed plasmid)宿主内含有质粒，但无异样性状表现。但可 能有的新性状并不被人们发现。3. 质粒的不相溶性任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时 存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性， 不相容性的质粒组成不相容性群以大肠杆菌的质粒为例：> ColEI、pMB1拥冇相似的复

6、制子结构，彼此不相容> PSC101、F、RP4拥冇相似的复制子结构，彼此不相容> p15A及其衍生质粒拥冇相似的复制子结构，彼此不相容4.质粒DNA的分离纯化实越塞一般使用下列三种方法制粒DNAz氯化絶密度梯度离心法质粒DNAitax.周期歩、设备要求«、 涣乙锭污洪沸水浴法质粒DNMfe度底、快逹、操作箱便 M溶法质粒DNMfe度、操作眉期介于氯化傩法 和械溶法之间氯化絶密度梯度离心法金用含有EDTA的缓冲液悬淳菌偵 加溶菌细胞St 加csa和涣乙鶴 超逹离心过夜在紫外灯下吸取0DNA 稻释沉淀CCCONATiff.4 亠11ocDNA L-ONAcccDNA-RNA

7、s繃溶法tI.-Q4MIA -L-ONA -cccDNA去TUJNA- oeDNA-用含有ED7A的鑲冲液悬浮 加溶菌驕覲«»细菌细胞蟹 ImNoOH和SDS的温含濬液. 戟释放内含愉加高浓度的01酸钾溶液砂染色体 去除樂 色体DNU大棉分*白康 离心取上清液用苯酚TR仿萃取，去 除痕的9白JR乙81或异丙SI沉淀水相廣粒DNA 用无DNas©的RNas©去除歿余的RNA用含有ED7A和THton XJOO的鑲沖 液悬浮菌体加溶fmai*錮菌细JM 涤水浴40砂钟离心.用无菌牙签挑去沉淀输乙酵或异丙SI沉淀康粒DNA5.质粒载体必须具备的基本条件(1)具

8、有复制起点(ORI)(2)具有抗菌素抗性基因是筛选的标志。理想的载体应该有两 种抗菌素抗性基因。(3) 若干限制性内切酶的单一位点:用来插入外源DNA片断。且插入后不影 响复制功能。6.质粒的选择标记及其工作原理:(1)选择标记(AmpO (Kany (TetO (SZrO (CmlO特异地使氯霉Kan)通过与70S核糖体结合, 生错读。杀死细菌。导致mRNA发ii）氯霉素（chloramphenicol > Cml）a）抑菌原理通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀 死生长的细菌。b）细菌抗性原理6/编码乙酰转移酶, 素乙酰化而失活。iii）卡那霉素（k

9、anamycin,a）杀菌原理b）细菌抗性原理Kam编码的氨基糖昔磷酸转移酶，对 卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结 合作用。iv）链霉素（Streptomycin, Str）a）杀菌原理通过与30S核糖体亚基结合，导致 mRNA错译。杀死细菌。b）细菌抗性原理Sb编码一种氨基糖昔磷酸转移酶对链 霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚 基结合作用。V）四环素（Tetracycline, Tet）a）抑菌原理通过与30S核糖体亚基结合，干扰细胞 蛋白质的合成并阻止肽键的形成。杀 死生长的细菌。b）细菌抗性原理编码特异性蛋白质，对细菌的膜结 构进行修饰，组止四环素通过细胞膜进 入细菌细胞内。抗生素的

10、作用及细1B的宛性墳式、F:存«度 <mg nil-)(pg/niL>tv用 at理优n K理«节庁*'150於#h貝能杀死正衣主长的A：tt 仟前上枣通过抑«»««玄联 血掏制细.也喉詢仟成P tMKt*RcWfrtifta Tcnw #C ii入细艳之将壮盘<«M«K :mrTW)10205osRWfWtf-«1fi瓦h：用而抑iKu基转拶n、从丽 抑制罐门«的合逍去希«乙就转b以兴詔S 誓索D环««':fff T U- 1 m

11、ol/L pt IS. 0的s酿常覆 沖中)102M示优只能於比生K中的大驹霸 «通过凯比【丙««桜变为 TV向q战及押制I）內氯股的馱 »形锻而抑制细罔细取的令戈变町1内毅M特jg条洗关大序索1015杀*"35过核W体旳S1E基的1.6 flirt结令时皿制缩1«的血门 順合成乙酰料移簡珈«* 序愎仲!«»«吋以火活庆大 馬素”/ «R（S«；friL6ilff"n 的翼奄町限止庆A;捲素的拈合1030杀済，可以抑制处白质的合成. Wtttt位以及#嫂1»

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13、耳结合而抑制RNA的令成利 «¥的敏出件是显性的 ttr».?liiMfU；BfeiRNA从A 位列 P位的移位RNA«合的变只可Will止利 權平勺英形成复合物利極申的 抗性/占©性的MS*5030杀菌:通过与30S枚糖体®单位 的S12蛋a佶合和押制正确的 翔译而抑制笛白质合成。链素 的緞感性是显性的四环秦（泊丁 70% 乙1212杀藻通过S止旣仮7与檢 糖陣A伦的结合*抑制细朗麦 白质的合成厂丿运基囚（编码Sb £自）的突 变可WIBjh壮观矗的结合壮 双«索的tt感性是a性的両抗 性左闪&»

14、;性的氛基糖昔隣酸转移fW可M灭活 ««素rp止塞因（编RS】2蛋 白）突变可WW止確零素的结 合链««挤性总性的主动地药物从细&荐出M所有的生*均于无W的去焉子水姿料来自 Fx© （1983） Gottlieb And Shaw1967）和 Mowed 糾nl NuUw «1987） b覚了囚环索保春于一200其他均应保存于40,除非另有毙乐U二一_二二C. WW««可以以同样的浓S代讐氨节青«素.节青毎索溶于30%乙/5Q%水中贮存于一20P dD环丝氯酸溶汝不稳定，应该在略用前餅配.e对光救

15、感应保存于黑暗处.-遗传标记使受体菌发生遗传性状的改变的基因。常用的遗传标记及检测方法*养标记划铁或印平«落于ft有戒不具村得检测的件养展分但含冇其他行种©药的tt*血卄 的平板I：划线或够卬平fe*落于含有或不含有某种抗生索的甲45 1：并乞*pielac2*在含有XalffllFK；的LB平板上划线培养维«见1.4) 血？ «耕应诛变此而A照曲 悚血朋一W不应变八FMF'recA用pUC质粒和对M质粒如PBR322转化人S杆菌桥转化体划线F含有XrqI和IPTG的 «¥抗性LB平板上.pUC质粒化的W落应该变童而对照股粒如

16、PBR322转化的flUV 应娈蓝務MISRSM体涂布细上应谈«到小的噬«斑(见I. 15)用i帳牙签在LB平板上划一条水平线，同a格"04対照菌也划一条水于线侏后用一低 板遮住平板的1半用手提紫外灯在254 nm績外)t下以3X lCr*J/cW照射半扳(通常萦 外灯离平板50 cm闇射20细莆对«外线十分敏出，没有被低欲3住的"tA-细W应被这一水平的射线杀死r«M7?将液和W 液井排点在细二者应该形成大小儿乎相同的噬穷斑3S(1用来自于 W5-或者加dK宿主W的不同的稀秆度的A嚨菌体感染突变尊檢和野生型 曲株如臬«躺体

17、来自于加dS宿主脚那么它中形展吟斑的效率比在 K生衆嚥株中形成超W斑的效事要离10“到10肩倍如集是來自hPR gdZMMU 宿主曲那二軒形成斑M效*戍足样的(2)«总一个糠于«设的后dS-SR的新鮮IBSJHT ImL Ai«a体感«神臧中，用 人切STW株:W野生斥JW株満定AWM体悬液思 ws »株上形成的克斑效a应«比 f生救*株高10到10*辖每个场斑约冇10-个咖®体hMR ZS-("同以上步舉(1人只地燻W体来溪干huiS-宿主繭(2或悬-个新噬91于1 ml“人嚨W体稀稀缓冲液中在AM/r践快利,f

18、生眾W株上进 行縄定二者形成噬斑的效率应该一样iiam用带有M6c !和&/I «切位点的质粒转代谏繭株和If生頑翦林从两曲傑中讯取歳粒 來自/am菌株的质粒仍曉枝Mho 11 Beil识別demIon用带ScrE I «切位点的质粒转化该«»|1野生型»»从两菌»中提鬼质粒用 »切定只有于dc»r菌抹的«粒才会35全切开即* INA a 皿!卩化05行 -半的SerE I位点可tt切开曇酗在LB平板上划續W养miWft.ra对用野生菌株划线培养作为对M，于srt堵供"。财 克

19、陆应«较大发亮并且有粘性匕农中所用的方法涉及墙养基的准&见11，在平上的划线和形印培养(见13以及体来稼的«体的 操作.b編码k半91糖甘側的n片 （2）抗菌素选择原理不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在 含有抗菌素的培养基（选择培养基）中 生长。当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌 后，受体菌才能生长。Z活7. 构建质粒载体的基本原则:a）选用合适的出发质粒b）获得构建质粒克隆载体的元件C）组装合适的选择标记基因d）选用合适的启动子e）提高外源DNA的容量f）需要灭活出发质粒上的某些编码基因g）构建过程力求简单8. 质粒改造的主要方法:a）减小体积b）减少限制性内切

20、酶切点C）便于检测的改造d）复制特性的改造e）质粒安全性的改造f）性状表达的改造9. 人工构建的质粒载体的类型（1）高拷贝数的质粒载体CoIEl. pMBl派生质粒具有高拷贝数 的特点。而且在没有菌体蛋白质合成的条件下 （蛋白质合成抑制剂，氯霉素等存在 下）仍能复制，达3!每个细胞的拷贝 数10003000个！适合大量增殖克隆基因、或需要表达 大量的基因产物。(2)低拷贝数的质粒载体由pSClOl派生来的载体特点是分子量小, 拷贝数低。PLG338、PLG339、pHSG415等不适合大量扩增DNA用O 但有特殊用途：(3)失控的质粒载体runaway plasmid vectors这是一类温度敏感型复制控制质粒。1979年BE. Uhlin等构建。如PBEU1、PBEU2o-tp【会很快增温度低(低于37 OC),拷贝