生物化学核酸化学课件

1、生物化学核酸化学第一节第一节 核酸的概念、分类和功能核酸的概念、分类和功能 第二节第二节 核酸的组成和分子结构核酸的组成和分子结构 第三节第三节 DNADNA的结构的结构 第五节第五节 核酸的性质及分离、分析核酸的性质及分离、分析 第六节第六节 核酸的应用核酸的应用第四节第四节 RNARNA的结构的结构 生物化学核酸化学第一节第一节 核酸的概念、分类和功能核酸的概念、分类和功能一、染色体和基因一、染色体和基因二、核酸概念和分类二、核酸概念和分类生物化学核酸化学在生物细胞核中存在在生物细胞核中存在着一种能被碱性染料着着一种能被碱性染料着色的螺旋集缩体。色的螺旋集缩体。这是由核酸、这是由核酸、 组

2、蛋白组蛋白、非组蛋白等组成，称、非组蛋白等组成，称此物质为染色体。此物质为染色体。一、染色体和基因一、染色体和基因生物化学核酸化学 染色体的形成：染色体的形成： DNA+DNA+组蛋白组蛋白= =核小核小体；体； 核小体绕成螺线核小体绕成螺线管状管状( (染色质丝染色质丝) )； 染色质丝染色质丝+ +非组蛋非组蛋白白= =染色体；染色体；一、染色体和基因一、染色体和基因生物化学核酸化学核酸：核酸： DNA-DNA-脱氧核糖核苷酸脱氧核糖核苷酸 RNA- RNA-核糖核苷酸核糖核苷酸 一、染色体和基因一、染色体和基因生物化学核酸化学核糖核酸核糖核酸（ribonucleic acid-ribon

3、ucleic acid-RNARNA） 转移转移RNA(transfer RNA-RNA(transfer RNA-tRNAtRNA) ) 信使信使RNA(messenger RNA-RNA(messenger RNA-mRNAmRNA) ) 核糖体核糖体RNARNA（ribosomal RNA-ribosomal RNA-rRNArRNA）脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid- deoxyribonucleic acid- DNADNA）二、核酸的概念和分类二、核酸的概念和分类生物化学核酸化学真核生物真核生物原核生物原核生物 DNA细胞核（细胞核（95%95%

4、）线粒体、叶绿体（线粒体、叶绿体（5%5%）核质区（拟核）核质区（拟核） RNA细胞质（细胞质（75%75%）线粒体、叶绿体（线粒体、叶绿体（15%15%）细胞核（细胞核（10%10%）细胞质细胞质二、核酸的概念和分类二、核酸的概念和分类生物化学核酸化学DNADNA功能：功能：遗传信息的载体，负责遗遗传信息的载体，负责遗传信息的贮存和发布。传信息的贮存和发布。RNARNA功能：功能：参与遗传信息的表达。参与遗传信息的表达。二、核酸的概念和分类二、核酸的概念和分类生物化学核酸化学核酸核酸核苷酸核苷酸磷酸磷酸核苷核苷戊糖戊糖碱基碱基水水解解核蛋白核蛋白蛋白质蛋白质第二节第二节 核酸的组成和分子结构

5、核酸的组成和分子结构 组成元素（组成元素（C,H,O,N,P）生物化学核酸化学许多个许多个第二节第二节 核酸的组成和分子结构核酸的组成和分子结构 生物化学核酸化学一、戊糖一、戊糖 三、核苷三、核苷二、碱基二、碱基四、核苷酸四、核苷酸第二节第二节 核酸的组成和分子结构核酸的组成和分子结构 五、核酸五、核酸生物化学核酸化学组成核酸的戊糖有两种组成核酸的戊糖有两种 组成组成DNADNA 组成组成RNARNA一、戊糖一、戊糖生物化学核酸化学二、碱基二、碱基1.1.嘧啶碱基嘧啶碱基2.2.嘌呤碱基嘌呤碱基生物化学核酸化学核酸中的碱基分两类：核酸中的碱基分两类：（1 1）嘧啶碱：）嘧啶碱：胞嘧啶（胞嘧啶（

6、C C） 尿嘧啶（尿嘧啶（U U） 胸腺嘧啶（胸腺嘧啶（T T）（2 2）嘌呤碱：）嘌呤碱：腺嘌呤（腺嘌呤（A A） 鸟嘌呤（鸟嘌呤（G G）二、碱基二、碱基生物化学核酸化学1.1.嘧啶碱基嘧啶碱基生物化学核酸化学2.2.嘌呤碱基嘌呤碱基生物化学核酸化学三、核苷三、核苷1.1.核苷的结构核苷的结构2.2.核苷的书写核苷的书写生物化学核酸化学w核苷是一种糖苷，由戌糖和碱基缩合而成。核苷是一种糖苷，由戌糖和碱基缩合而成。w糖与碱基之间以糖苷键相连接。糖的第一糖与碱基之间以糖苷键相连接。糖的第一位上的碳原子（位上的碳原子（C1）与嘧啶碱的第一位上）与嘧啶碱的第一位上的氮原子（的氮原子（N1）或嘌呤碱

7、的第九位上的氮）或嘌呤碱的第九位上的氮原子（原子（N9）相连，所以糖与碱基间的连键）相连，所以糖与碱基间的连键是是N-C键，一般称之为键，一般称之为N-糖苷键。糖苷键。w蛋白质与糖连接时，天冬酰氨的氨基与半蛋白质与糖连接时，天冬酰氨的氨基与半缩醛羟基间形成的为缩醛羟基间形成的为N-糖苷键。糖苷键。1.1.核苷的结构核苷的结构生物化学核酸化学胞嘧啶核苷尿嘧啶核苷鸟嘌呤核苷腺嘌呤核苷NNOHHONNNH2HONNOHH2NNNNNNNNH2OHHOHHOHHHOCH2HOCH2OHHOHHOHHOHHOHHOHHHOCH2OHHOHHOHHHOCH2糖与碱基之间以糖与碱基之间以C-NC-N糖苷键连

8、接糖苷键连接11191.1.核苷的结构核苷的结构生物化学核酸化学2.2.核苷的书写核苷的书写w核苷可用单字符号核苷可用单字符号A（腺嘌呤核苷，简称（腺嘌呤核苷，简称腺苷）、腺苷）、G（鸟苷）、（鸟苷）、C（胞苷）、（胞苷）、U（尿（尿苷）表示。苷）表示。w脱氧核苷则在单字符号前面加一个小写脱氧核苷则在单字符号前面加一个小写的的d，如，如dA（腺嘌呤脱氧核糖核苷，简称（腺嘌呤脱氧核糖核苷，简称脱氧腺苷）、脱氧腺苷）、dG（脱氧鸟苷）、（脱氧鸟苷）、dC（脱（脱氧胞苷）、氧胞苷）、dT（脱氧胸苷）。（脱氧胸苷）。生物化学核酸化学1 1核苷酸的种类核苷酸的种类2 2核苷酸的结构与命名核苷酸的结构与命

9、名3 3多磷酸核苷及其衍生物多磷酸核苷及其衍生物4 4环核苷酸环核苷酸5 5核苷酸的性质核苷酸的性质四、核苷酸四、核苷酸生物化学核酸化学核苷中的戌糖羟基被磷酸酯化，就形成核苷酸核苷中的戌糖羟基被磷酸酯化，就形成核苷酸作为作为DNA或或RNA结构单元的核苷酸分别是结构单元的核苷酸分别是5-磷酸磷酸-脱氧核糖核苷和脱氧核糖核苷和5-磷酸磷酸-核糖核苷。核糖核苷。1 1核苷酸的种类核苷酸的种类生物化学核酸化学 腺腺嘌嘌呤呤 A 鸟鸟嘌嘌呤呤 G 胞胞嘧嘧啶啶 C 尿尿嘧嘧啶啶 U 胸胸腺腺嘧嘧啶啶 T RNA AMP GMP CMP UMP 未未发发现现 DNA dAMP dGMP dCMP 未未发

10、发现现 dTMP lRNARNA的名称为某（单、二、三）磷酸核苷酸，的名称为某（单、二、三）磷酸核苷酸，DNADNA在某（单、二、三）前加脱氧两字。在某（单、二、三）前加脱氧两字。l如如AMPAMP称腺苷磷酸称腺苷磷酸( (或腺苷酸），或腺苷酸），dAMPdAMP称为脱氧称为脱氧腺苷磷酸（脱氧腺苷酸）。腺苷磷酸（脱氧腺苷酸）。2 2核苷酸的结构与命名核苷酸的结构与命名生物化学核酸化学参与核酸生物合成的直接参与核酸生物合成的直接原料不是一磷酸核苷酸，而原料不是一磷酸核苷酸，而是三磷酸核苷酸，如是三磷酸核苷酸，如ATP ATP （三磷酸腺苷酸）。（三磷酸腺苷酸）。ATPATP上的磷酸残基用上的磷酸

11、残基用、来编号。来编号。ATPATP含有两个高能磷酸酯键（含有两个高能磷酸酯键（P P），其水解时释），其水解时释放出的能量为放出的能量为7.37.3千卡千卡/ /克分子（普通磷酸酯键为克分子（普通磷酸酯键为2 2千卡千卡/ /克分子）。克分子）。ATPATP在细胞能量代谢中起着及其重要的作用。在细胞能量代谢中起着及其重要的作用。3 3多磷酸核苷及其衍生物多磷酸核苷及其衍生物生物化学核酸化学3 3多磷酸核苷及其衍生物多磷酸核苷及其衍生物生物化学核酸化学4 4核苷酸的性质核苷酸的性质w碱基可以发生酮式和烯醇式的互变异构，体碱基可以发生酮式和烯醇式的互变异构，体内以酮式为主。内以酮式为主。w核苷酸

12、在核苷酸在240290 nm具有强烈的光吸收，具有强烈的光吸收，最大吸收波长在最大吸收波长在260 nm左右。左右。w核苷酸是两性电解质，在不同的核苷酸是两性电解质，在不同的pH条件下，条件下，其解离程度不同，在某一其解离程度不同，在某一pH值时，对外不表值时，对外不表现出电性，该现出电性，该pH值称为其等电点。值称为其等电点。一般物理性质：一般物理性质：生物化学核酸化学一、一、DNA的一级结构的一级结构 三、三、DNA的三级结构的三级结构 二、二、DNA的二级结构的二级结构 四、核酸序列的研究方法四、核酸序列的研究方法第三节第三节 DNADNA的结构的结构 五、五、DNA基因组基因组生物化学

13、核酸化学一、一、DNA的一级结构的一级结构 w双链线性分子双链线性分子:真核真核细胞核内的细胞核内的DNA、有些动物病毒。、有些动物病毒。w环状双链环状双链DNA:原核生物染色体原核生物染色体DNA、质粒、质粒DNA、真核生物细胞器、真核生物细胞器DNA、有些动物病毒。、有些动物病毒。 生物化学核酸化学各核苷酸残基沿多核各核苷酸残基沿多核苷酸链排列的顺序叫核苷酸链排列的顺序叫核酸的一级结构。酸的一级结构。连接键：连接键：3 3，5 5一磷酸一磷酸二酯键连接起来的直线二酯键连接起来的直线形或环形分子。形或环形分子。DNADNA没有侧链。没有侧链。一、一、DNA的一级结构的一级结构 生物化学核酸化

14、学5PPPPPP 3 或或 5 3一、一、DNA的一级结构的一级结构 生物化学核酸化学公认的为公认的为1953年年watson和和crick提提出的出的DNA双螺旋双螺旋结构模型。结构模型。二、二、 DNA的二级结构的二级结构 生物化学核酸化学二、二、 DNA的二级结构的二级结构 1 1B-DNAB-DNA双螺旋结构模型的要点双螺旋结构模型的要点2 2双螺旋结构的稳定性双螺旋结构的稳定性3 3DNADNA双螺旋的不同类型双螺旋的不同类型生物化学核酸化学（1）w两条两条多核苷酸链组成；多核苷酸链组成；w反向平行反向平行（p5-糖糖3-p的结构与的结构与p3-糖糖5-p的结构相对）的结构相对）w两

15、条链的糖磷酸主链都是两条链的糖磷酸主链都是右手螺旋右手螺旋，有一共同螺旋轴，有一共同螺旋轴1 1B-DNAB-DNA双螺旋结构模型的要点双螺旋结构模型的要点生物化学核酸化学（2）两条链上的碱基互补配对：）两条链上的碱基互补配对：wA-T，C-G或或T-A，G-C；wA与与T之间为二个氢键，之间为二个氢键，C与与G之间为三个氢键。之间为三个氢键。1 1B-DNAB-DNA双螺旋结构模型的要点双螺旋结构模型的要点生物化学核酸化学1 1B-DNAB-DNA双螺旋结构模型的要点双螺旋结构模型的要点w双螺旋的螺距为双螺旋的螺距为3.4 nm，螺旋的直径为，螺旋的直径为2 nm，相邻碱基对平面，相邻碱基对

16、平面间的距离是间的距离是0.34 nm。w双螺旋的每一转有双螺旋的每一转有10对对核苷酸，相邻核核苷酸，相邻核苷酸之间的夹角为苷酸之间的夹角为36。 （3）生物化学核酸化学螺 旋 表螺 旋 表面有一条面有一条大沟和一大沟和一条小沟条小沟大沟大沟小沟小沟1 1B-DNAB-DNA双螺旋结构模型的要点双螺旋结构模型的要点（4）生物化学核酸化学1 1B-DNAB-DNA双螺旋结构模型的要点双螺旋结构模型的要点（5）碱基平碱基平面与双螺旋的面与双螺旋的中心轴垂直，中心轴垂直，糖环平面与中糖环平面与中心轴平行。心轴平行。生物化学核酸化学1 1B-DNAB-DNA双螺旋结构模型的要点双螺旋结构模型的要点（

17、6）双螺旋）双螺旋结构横向靠氢结构横向靠氢键稳定，纵向键稳定，纵向靠碱基堆积力靠碱基堆积力维系稳定。维系稳定。生物化学核酸化学1 1B-DNAB-DNA双螺旋结构模型的要点双螺旋结构模型的要点（7）w一个链的碱基顺序确定后，则另一条链必有相对一个链的碱基顺序确定后，则另一条链必有相对应的碱基顺序。应的碱基顺序。w碱基互补原则具有极重要意义，碱基互补原则具有极重要意义，DNA复制、转录、复制、转录、反转录等过程的分子基础都是反转录等过程的分子基础都是碱基互补配对。碱基互补配对。ATGAACAGCT TCAATAAGGA CGAGTTTGACTACTTGTCGA AGTTATTCCT GCTCAA

18、ACTG生物化学核酸化学（1 1）氢键；）氢键；（2 2）离子键及范德华力；）离子键及范德华力；（3 3）碱基堆积力；）碱基堆积力；2 2双螺旋结构的稳定性双螺旋结构的稳定性生物化学核酸化学（1 1）氢键：）氢键：两条链间碱基的相互作用，两条链间碱基的相互作用，A A与与T T之间为二条氢键，之间为二条氢键，C C与与G G之间为三条氢键。氢键作之间为三条氢键。氢键作用力很弱，但用力很弱，但DNADNA分子中存分子中存在大量氢键，因此氢键为在大量氢键，因此氢键为一重要稳定因素；一重要稳定因素；2 2双螺旋结构的稳定性双螺旋结构的稳定性生物化学核酸化学（2 2）离子键及范德华力：）离子键及范德华

19、力：DNADNA分子中磷酸基因在生分子中磷酸基因在生理条件下解离，使理条件下解离，使DNADNA成为一种多阴离子，这有利于成为一种多阴离子，这有利于它与带正电荷的其它阳离子基团发生静电作用，这样它与带正电荷的其它阳离子基团发生静电作用，这样减少双链间的静电排斥，有利于双螺旋的稳定；减少双链间的静电排斥，有利于双螺旋的稳定；（3 3）碱基堆积力：）碱基堆积力：目前普遍认为堆积碱基间的疏水目前普遍认为堆积碱基间的疏水作用是稳定作用是稳定DNADNA结构的更重要的因素。大量碱基层层结构的更重要的因素。大量碱基层层堆积，两相邻碱基的平面十分贴近，于是使双螺旋结堆积，两相邻碱基的平面十分贴近，于是使双螺

20、旋结构内部形成一个强大的疏水区，与介质中的小分子隔构内部形成一个强大的疏水区，与介质中的小分子隔开，有利于互补碱基之间氢键的形成；开，有利于互补碱基之间氢键的形成；2 2双螺旋结构的稳定性双螺旋结构的稳定性生物化学核酸化学3 3DNADNA双螺旋的不同类型双螺旋的不同类型B型型DNA（BDNA）:在相对湿度在相对湿度为为92%时，所得到的时，所得到的DNA钠盐纤维；钠盐纤维；A型型DNA（ADNA）:在相对湿度在相对湿度低于低于75%时，获得的时，获得的DNA钠盐纤维；钠盐纤维；此外还有此外还有ZDNA等；等；生物化学核酸化学3 3DNADNA双螺旋的不同类型双螺旋的不同类型生物化学核酸化学三

21、、基因组三、基因组w基因组基因组是指生物体的单倍体细胞核、细胞器是指生物体的单倍体细胞核、细胞器或病毒粒子所含的全部或病毒粒子所含的全部DNA分子或分子或RNA分子分子的总和。的总和。w为了揭示生命奥秘，必须要测定生物体的基为了揭示生命奥秘，必须要测定生物体的基因组序列因组序列-基因组计划基因组计划。w目前已经完成了病毒、大肠杆菌、酵母、果目前已经完成了病毒、大肠杆菌、酵母、果蝇、玉米、水稻和人类基因组的测序，得出人蝇、玉米、水稻和人类基因组的测序，得出人类基因组的大小为类基因组的大小为3109 bp，用于编码蛋白质，用于编码蛋白质的基因序列约为的基因序列约为31 000个，只占基因组的个，只

22、占基因组的1.1%1.4%。生物化学核酸化学一、一、RNA的一级结构的一级结构 二、二、 RNA的高级结构的高级结构 第四节第四节 RNARNA的结构的结构 生物化学核酸化学1.1.一级结构的定义一级结构的定义2.2.一级结构的特点一级结构的特点一、一、RNA的一级结构的一级结构 生物化学核酸化学1.1.一级结构的定义一级结构的定义wRNA的一级结构指的的一级结构指的是多核苷酸链中是多核苷酸链中核糖核核糖核苷酸苷酸的排列顺序，即多的排列顺序，即多核苷酸链中核苷酸链中碱基碱基的排列的排列顺序。顺序。wRNA也是无分支的也是无分支的线线形形结构。结构。生物化学核酸化学w含腺嘌呤、鸟嘌呤、含腺嘌呤、

23、鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶四种胞嘧啶和尿嘧啶四种碱基，尚含有多种碱基，尚含有多种“稀有碱基稀有碱基”和特殊和特殊形式的核苷。形式的核苷。w其中以各种甲基化其中以各种甲基化的碱基和的碱基和“假尿嘧啶假尿嘧啶核苷核苷”尤为丰富。尤为丰富。假尿苷假尿苷 w这些不寻常的成分可能与这些不寻常的成分可能与tRNA的生物学功的生物学功能有一定的关系。能有一定的关系。1.1.一级结构的定义一级结构的定义生物化学核酸化学含量含量: :占总占总RNARNA的的5%5%。 存在：存在：在细胞核中以在细胞核中以DNADNA为模板被合成以后，可为模板被合成以后，可能暂存于能暂存于核仁核仁内，也可能立即转移到内，也可能立即转

24、移到胞质胞质中，并中，并以每分子以每分子mRNAmRNA与几个或几十个核蛋白体结合成串与几个或几十个核蛋白体结合成串珠样的多核蛋白体形式而存在。珠样的多核蛋白体形式而存在。特点：特点：一般都很不稳定，代谢活跃，更新迅速，一般都很不稳定，代谢活跃，更新迅速，寿命较短，种类很多。寿命较短，种类很多。功能功能: :在蛋白质生物合成中起传递遗传信息的作在蛋白质生物合成中起传递遗传信息的作用，故也叫信息用，故也叫信息RNARNA（iRNAiRNA）。）。2.2.一级结构的特点（一级结构的特点（mRNAmRNA）生物化学核酸化学真核真核 单顺反子单顺反子5 -5 -末端有末端有“帽子帽子”3 -3 -末端

25、有末端有polyApolyA片段片段原核原核 多顺反子多顺反子5 -5 -末端无末端无“帽子帽子”3 -3 -末端末端 无无polyApolyA片段片段w顺反子：顺反子： mRNA上具有翻译功能的核苷酸顺序。上具有翻译功能的核苷酸顺序。w单顺反子：单顺反子：只编码一个蛋白质的只编码一个蛋白质的mRNA。wpolyApolyA片段：片段：指指10200个多聚腺苷酸，这与个多聚腺苷酸，这与mRNA顺顺利通过核膜进入胞浆有关，也与利通过核膜进入胞浆有关，也与mRNA从细胞核转移从细胞核转移到核糖体的过程有关，也有人认为与病毒侵染性有关。到核糖体的过程有关，也有人认为与病毒侵染性有关。 w“帽子帽子”

26、结构：结构： 5-末端的末端的G被甲基化，通过焦磷酸被甲基化，通过焦磷酸与另一个发生了核糖上甲基化的核苷酸以与另一个发生了核糖上甲基化的核苷酸以5、 5-磷磷酸二酯键相连酸二酯键相连,此结构对此结构对mRNA的翻译活性是重要的。的翻译活性是重要的。 2.2.一级结构的特点（一级结构的特点（mRNAmRNA）生物化学核酸化学2.2.一级结构的特点（一级结构的特点（mRNAmRNA）生物化学核酸化学含量：含量：占细胞总占细胞总RNA的的75-80%。存在：存在：与蛋白质结合成核蛋白的形式，存在于与蛋白质结合成核蛋白的形式，存在于细胞质的核蛋白体中。细胞质的核蛋白体中。功能：功能：以核蛋白体的形式在

27、蛋白质生物合成中以核蛋白体的形式在蛋白质生物合成中提供合适的工作场所。提供合适的工作场所。分子量分子量:它的分子量都比较大，大肠杆菌核糖体它的分子量都比较大，大肠杆菌核糖体中有三类中有三类rRNA（它们的沉降系数分别为（它们的沉降系数分别为5S、16S、23S）；动物细胞核糖体）；动物细胞核糖体rRNA有四类（有四类（5S 、 5.8S 、 18S和和28S）。）。2.2.一级结构的特点（一级结构的特点（rRNArRNA）生物化学核酸化学大肠杆菌大肠杆菌5SRNA5SRNA的结构的结构2.2.一级结构的特点（一级结构的特点（rRNArRNA）生物化学核酸化学w原核生物：原核生物：是由是由30S

28、和和50S两个亚基组两个亚基组成的成的70S的的rRNA和蛋白质聚合体，其中和蛋白质聚合体，其中rRNA含含66。w真核生物：真核生物：是由是由60S和和40S两个亚基组两个亚基组成的成的80S的的rRNA和蛋白质聚合体，其中和蛋白质聚合体，其中rRNA含含60。2.2.一级结构的特点（一级结构的特点（rRNArRNA）生物化学核酸化学含量：含量：约占细胞总约占细胞总RNARNA的的101015%15%。存在：存在：tRNAtRNA溶于溶于“胞液胞液”部分中，它们以自由部分中，它们以自由状态或以氨基酸结合状态而存在。状态或以氨基酸结合状态而存在。分子量：分子量：由由60609595个核苷酸残基

29、组成，都较小个核苷酸残基组成，都较小功能：功能：蛋白质的生物合成中起选择性运输原料蛋白质的生物合成中起选择性运输原料（氨基酸）的作用，因此把（氨基酸）的作用，因此把tRNAtRNA叫受体叫受体RNARNA。每种。每种氨基酸都有对应的一种或几种氨基酸都有对应的一种或几种tRNAtRNA。2.2.一级结构的特点（一级结构的特点（tRNAtRNA）生物化学核酸化学tRNAtRNA的三叶草型结构特点（总）的三叶草型结构特点（总）反反密码环密码环二、二、 RNA的高级结构的高级结构 氨基酸接受区（氨氨基酸接受区（氨基酸臂）基酸臂）二氢尿嘧啶区二氢尿嘧啶区反密码区反密码区TCTC区区额外环（可变区）额外环

30、（可变区） 氨基酸臂二氢尿嘧啶区二氢尿嘧啶区额外环额外环TC区生物化学核酸化学tRNA分子中含分子中含有修饰碱基，但多有修饰碱基，但多少不等。在某些位少不等。在某些位置上的核苷酸对于置上的核苷酸对于所有的所有的tRNA都是都是同样的，或变化很同样的，或变化很少叫做不变核苷酸少叫做不变核苷酸。稀有碱基稀有碱基二、二、 RNA的高级结构的高级结构 生物化学核酸化学第五节第五节 核酸的性质及分离、分析核酸的性质及分离、分析 一、核酸的理化性质一、核酸的理化性质二、核酸的分离二、核酸的分离三、核酸的分析三、核酸的分析四、核酸测序的研究方法四、核酸测序的研究方法生物化学核酸化学1 1相对分子质量相对分子

31、质量2 2粘度与沉降特性粘度与沉降特性3 3紫外吸收紫外吸收4 4变性与复性变性与复性5 5熔解温度熔解温度6 6克原子磷消光系数克原子磷消光系数一、核酸的理化性质一、核酸的理化性质生物化学核酸化学w 纯品纯品DNA为白色纤为白色纤维状固体，维状固体，RNA为白为白色粉末。色粉末。w DNA、RNA及核苷及核苷酸为极性化合物，溶酸为极性化合物，溶于水，不溶于有机溶于水，不溶于有机溶剂。剂。DNA能被乙醇和能被乙醇和异戊醇沉淀。异戊醇沉淀。 核酸的物理特性核酸的物理特性生物化学核酸化学核酸的两性解离核酸的两性解离wDNA和和RNA都为两性电解质，都为两性电解质，具有等电点。具有等电点。w核酸在核

32、酸在pH4时，带负电荷时，带负电荷等电点（等电点（pI）：）：pIpIpKa1pKa1pKa2pKa22 2生物化学核酸化学w DNA的相对分子质量较大，一般为的相对分子质量较大，一般为106109 bp，大多数，大多数DNA为线性分子，为线性分子，分子极不对称，虽然其长度可达厘米分子极不对称，虽然其长度可达厘米级但分子的直径只有纳米级。级但分子的直径只有纳米级。wRNA的相对分子质量较小，通常为的相对分子质量较小，通常为104106 bp。1 1相对分子质量相对分子质量生物化学核酸化学w DNA能被乙醇和异戊醇沉淀。能被乙醇和异戊醇沉淀。wDNA分子的粘度比分子的粘度比RNA分子的粘度要分子

33、的粘度要大得多大得多 。w不同相对分子质量的核酸沉降速度不不同相对分子质量的核酸沉降速度不同。一般情况下，超螺旋同。一般情况下，超螺旋DNA 环状环状DNA 线形线形DNA。 2 2粘度与沉降特性粘度与沉降特性生物化学核酸化学w嘌呤碱与嘧啶碱有嘌呤碱与嘧啶碱有共轭双键，使碱基共轭双键，使碱基核苷、核苷酸和核核苷、核苷酸和核酸在酸在240290nm紫紫外波段有一强烈的外波段有一强烈的吸收峰，最大吸收吸收峰，最大吸收值在值在260nm附近。附近。3 3紫外吸收紫外吸收生物化学核酸化学4 4变性与复性变性与复性（变性）（变性）定义：定义：指核酸双螺旋区氢键断裂，变成单链，它并不涉指核酸双螺旋区氢键断

34、裂，变成单链，它并不涉及共价键（磷酸二酯键）的断裂。及共价键（磷酸二酯键）的断裂。变性因素：变性因素：热变性、酸碱变性和化学变性等。热变性、酸碱变性和化学变性等。生物化学核酸化学定义：定义：变性变性DNADNA在适当条件下，又可使两条彼此分开的链在适当条件下，又可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构。重新缔合成双螺旋结构。退火退火4 4变性与复性变性与复性（复性）（复性）生物化学核酸化学DNADNA复性后，许多物化性质又得到恢复，生物活性可以得复性后，许多物化性质又得到恢复，生物活性可以得到部分恢复。但将热变性的到部分恢复。但将热变性的DNADNA骤然冷却，不能复性，只骤然冷却，不能复性，只

35、有缓慢冷却时才可以复性。有缓慢冷却时才可以复性。4 4变性与复性变性与复性（复性）复性）生物化学核酸化学4 4变性与复性变性与复性（复性）复性）影响核酸复性速度的因素很多：影响核酸复性速度的因素很多：核酸浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性核酸浓度越高，随机碰撞的频率越高，复性速度越快。速度越快。核酸分子越大，链间错配频率越高，复性速核酸分子越大，链间错配频率越高，复性速度越慢。度越慢。核酸链内重复序列多，易形成互补配对，复核酸链内重复序列多，易形成互补配对，复性速度较快。性速度较快。维持一定的溶液离子强度，消弱磷酸基静电维持一定的溶液离子强度，消弱磷酸基静电斥力，可加快复性速度。斥力，可加快复

36、性速度。 选择最佳的复性温度，温度太高会使核酸发选择最佳的复性温度，温度太高会使核酸发生变性，而温度过低会使错配的两链无法分开。生变性，而温度过低会使错配的两链无法分开。生物化学核酸化学通常把通常把DNADNA的双螺旋结构失去一半时的温度称该的双螺旋结构失去一半时的温度称该DNADNA的溶点或溶解温度，用的溶点或溶解温度，用TmTm表示，表示，DNADNA的的TmTm值一值一般在般在707085850 0C C之间。之间。变性的相对量变性的相对量温度温度0 0C C60801001.01.21.41.60TmTmTmTmTmTm100%Poly d(A-T)Poly d(G-C)DNA5 5熔

37、解温度熔解温度生物化学核酸化学 TmTm值的大小与下列因素有关：值的大小与下列因素有关： （1 1）DNADNA的均一性的均一性 （2 2）G-CG-C含量含量 （3 3）介质中的离子强度）介质中的离子强度5 5熔解温度熔解温度生物化学核酸化学（1 1）DNADNA的均一性：的均一性：一般均一性越高，一般均一性越高，TmTm值的变值的变动范围越小。动范围越小。（2 2）G-CG-C含量：含量：G-CG-C含量越高，含量越高，TmTm值越大，值越大，TmTm与与G-G-C C含量成正比关系。因为含量成正比关系。因为G-CG-C比比A-TA-T更稳定（氢键）。更稳定（氢键）。TmTm与所含与所含G

38、-CG-C的多少的关系，可用经验公式计算不的多少的关系，可用经验公式计算不同同DNADNA的的TmTm： （G GC C）(Tm(Tm69.3)69.3)2.442.445 5熔解温度熔解温度生物化学核酸化学（3 3）介质中的离子强度：）介质中的离子强度：一般离子强度一般离子强度较低，较低，DNADNA的的TmTm值也较低，范围也越窄。值也较低，范围也越窄。温度温度0 0C C70801001.21.41.5901.11.3 A A 2602600.010.020.050.20.10.51.0大肠杆菌大肠杆菌DNADNA在不同在不同KClKCl浓度下的浓度下的TmTm5 5熔解温度熔解温度生物

39、化学核酸化学6 6摩尔磷吸光系数摩尔磷吸光系数w核酸分子中磷原子的含量基本稳定。核酸分子中磷原子的含量基本稳定。w根据磷的含量测定核酸溶液的吸光度，根据磷的含量测定核酸溶液的吸光度，以每升核酸溶液中一摩尔磷为标准来以每升核酸溶液中一摩尔磷为标准来计算核酸的吸光系数，就叫做计算核酸的吸光系数，就叫做摩尔磷摩尔磷吸光系数吸光系数，用，用（P）表示。表示。生物化学核酸化学二、核酸的分离二、核酸的分离核酸的分离原则：核酸的分离原则：尽量简化操作，缩短提取过程；尽量简化操作，缩短提取过程；减少化学物质对核酸的降解；减少化学物质对核酸的降解；减少核酸的生物降解；减少核酸的生物降解；减少物理因素对核酸的降解

40、。减少物理因素对核酸的降解。生物化学核酸化学二、核酸的分离二、核酸的分离核酸的分离方法：核酸的分离方法：细胞裂解；细胞裂解；酶处理；酶处理；核酸的分离提纯：核酸的分离提纯：盐提取法盐提取法酚提取法酚提取法层析法。层析法。生物化学核酸化学三、核酸的分析三、核酸的分析w纯纯DNA的的OD260/2801.8。w纯纯RNA OD260/2802.0，如果样品中含有杂，如果样品中含有杂蛋白，比值会明显下降。蛋白，比值会明显下降。w如果如果OD260/2301.8时样品是纯的，否则样时样品是纯的，否则样品中含有杂多糖。通常品中含有杂多糖。通常1.0 OD相当于相当于50g/mL的双螺旋的双螺旋DNA或或

41、 40 g/mL单链单链DNA（或（或RNA）。）。紫外法紫外法生物化学核酸化学w1977年两位学者分别提出了年两位学者分别提出了化学断裂法化学断裂法和和双脱氧链终止法双脱氧链终止法。w这两种方法的基本原理相同，都是用不同这两种方法的基本原理相同，都是用不同的专一性手段使被分析的的专一性手段使被分析的DNA分子断裂成分子断裂成若干带放射性标记的、长短不一的片段，若干带放射性标记的、长短不一的片段，然后用测然后用测DNA片段的相对长度来测核苷酸片段的相对长度来测核苷酸的顺序。的顺序。四、核酸测序的研究方法四、核酸测序的研究方法生物化学核酸化学SangerSanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法四

42、、核酸测序的研究方法四、核酸测序的研究方法生物化学核酸化学GilbertGilbert化学断裂法化学断裂法四、核酸测序的研究方法四、核酸测序的研究方法DNA片段一端用放射性标记，片段一端用放射性标记，用碱基特异性的化学反应裂用碱基特异性的化学反应裂解解DNA，通过标定末端与断，通过标定末端与断裂位点之间的距离来确定碱裂位点之间的距离来确定碱基的位置。基的位置。生物化学核酸化学四、核酸测序的研究方法四、核酸测序的研究方法最新的测序方法：最新的测序方法：焦磷酸测序技术：焦磷酸测序技术： Roche公司的公司的GS FLX系统（系统（454系统）；系统）；桥扩增测序技术：桥扩增测序技术： Illum

43、ina公司的公司的Genome Analyzer系统系统（Solexa系统）；系统）；连接测序技术：连接测序技术： ABI公司的公司的SOLiD系统；系统；生物化学核酸化学第六节第六节 核酸的应用研究核酸的应用研究 一、人类基因组计划一、人类基因组计划二、分子杂交二、分子杂交三、小三、小RNARNA和微小和微小RNARNA四、反义四、反义RNARNA生物化学核酸化学一、人类基因组计划一、人类基因组计划1990年，美国国会批准美年，美国国会批准美国的国的“人类基因组计划人类基因组计划”于于10月月1日正式启动。美日正式启动。美国的人类基因组计划总体国的人类基因组计划总体规划是：拟在规划是：拟在15年内至少年内至少投入投入30亿美元，进行对人亿美元，进行对人类全基因组的分析。类全基因组的分析。生物化学核酸化学一、人类基因组计划一、人类基因组计划20032003年年4 4月月l4l4日，美、英、日、德、法、中六国首日，美、英、日、德、法、中六国首脑发表了脑发表了“人类基因组联合宣言人类基因组联合宣言”，宣告，宣告“人类基人类基因组计划因组计划”提前完成。提前完成。 生物化学核酸化学一、人类基因组计划一、人类基因组