注射用人脐带间充质干细胞稳定性研究资料

1、药品名称注射用人脐带间充质干细胞资料项目名称 稳定性试验资料及文献资料1 P2代种子细胞稳定性实验研究资料及文献资料1.11.21.31.41.52 P4代成品细胞稳定性实验研究资料及文献资料 样品批号及实验对应表格.2.L1影响因素试齡.2.1.2加速试验.2.1.3长期试验.考察方法及样品处理221影响因素试验.2.2.2加速试验.223长期试验检验方法及限度标准. 考察长期稳定性实验批号及方案简表.考察方法及样品处理.检验方法及限度标准.考察结果.结论.2.12.32.42.5.1影响因素试验.2.5.2加速试验.2.53长期试验.2.2.2.2.3.6.6.6.6.7.7.7.7.7.

2、8.8.9.9.9.11.13.13.13.13.14.14.14.15样品批号及数据对应表格考察方法及样品处理.检验方法及限度标准.2.4.12.4.22.4.3讨论.结果.影响因素试验.加速试验.长期试验（液氮中）2.52.6考察结论.3注射用人脐带间充质干细胞在保存液中的稳定性实验研究3.13.23.33.4第贞 共3 3 2 2页注射用人脐带间充质干细胞稳定性试验资料根据中华人民共和国药典2010年版二部附录XIX C项下药物稳定性试验指导原则”制剂部分，参考疫苗类生物制品的稳定性设计方案，设计并实施了注射用 人脐带间充质干细胞的稳定性试验。本资料在注射用人脐带间充质干细胞临床前生产工

3、艺及质量研究的基础上，对 本规格三批P2代种子细胞和三批P4代成品注射用人脐带间充质干细胞（规格：5.0XlCf个/管）在冻存期间以及复苏后的稳定性进行全面研究，现报告如下。供试品：注射用人脐带间充质干细胞样品来源:对应批号如下:本资料拟按上述细胞样品和批次进行稳定性实验研究，结果分别汇报如下:第2贞 共3 3 2 2页1 1 P2P2代种子细胞稳定性实验研究资料及文献资料1.11.1长期稳定性实验批号及方案简表表14-1注射用人脐带间充质干细胞种子细胞稳定性试验样品批号及数据放置条件规格批次检测时间（月）实验结果已完成待完成液氮2.0X107个/管1280200043J2010000. 6.

4、 12.2436,48.60表14-312802000011201000表14-412802000171201000表14-51-21-2考察方法及样品处理収注射用人脐带间充质干细胞P2代种子细胞（规格：2.0X107个/管）三个 批次样品(批号12802000431201000, 12802000011201000, 12802000171201000)作为供试品。于第0个月，6个月，2个月，24个月，36个月，48个月，60个月取样,按照临床前注射用人脐带间充质干细胞种子细胞检定规程（草案），选取细胞形态,细胞活率，无菌，支原体，细胞表面抗原分析，染色体核型分析，成骨成脂诱导潜能分析，原癌

5、基因抑癌基因分析，端粒酶活性分析等检测指标，考察本品在液氮中长期冻存的质量，见上表14-101313检验方法及限度标准临床研究用注射用人脐带间充质干细胞P2代种子细胞质量标准（草案）见下表14-2：详见注射用人脐带间充质干细胞临床申报资料13号。表14-2注射用人脐带间充质干细胞种子细胞质量标准（草案）检测项目检测方法标准规；4【性状】细胞形态镜检细胞贴壁生长时.呈梭形，应 为成纤维样细胞。【检査】细胞计数细胞计数仪检测标示量的90% 120%细胞活率细胞计数仪检测不低于85%无菌 需氧菌及真菌全自动细菌分枝杆菌阴性第3贞 共3 3 2 2贞厌氧菌及真菌培养监测系统检测法阴性支原体中国药典20

6、10版附录XH B符合规左【鉴别】细胞 表而 抗原分析CD 90流式细胞术（FCM）不低于95%CD 73不低于95%CD 105不低于95%CD 29不低于95%CD 45不得过2%CD 34不得过2%CD79a或CD19不得过2%CD 14不得过2%HLA-DR不得过2%【生物学活性检查】核型分析G显带核型分析法应为正常核型成卅成脂诱导分化潜能染色法具有成fl成脂诱导分化潜能端粒酶分析PCR法具有瑞粒酶活性原癌基因，抑癌基因荧光法原癌基因、抑癌基因表达无明 显变化1.41.4考察结果考察结果见下表14 314 5。图谱见附图1 11 84。表14 3 P2代种子细胞（批号:12802000

7、431201000）长期稳定性实验硏究结果检测项目检测时间0个月6个月12个月24个月细胞形态符伶规楚符合规立符合规立符合规左细胞活率93.6%90.7%91.0%907%细胞表 而抗原 分析CD105984%99.7%100%99CD 7399,6%96.1%99.8%98J%CD 90997%99.9%100.0%99,9%第4贞 共3 3 2 2贞CD 2999,9%100.0%100.0%993%CD 451.3%0.8%0J%0,8%CD 79 a或CD19L1%0.8%0.1%07%HLA-DR0,2%0.6%0.5%0.6%CD 340.5%03%0.1%0,9%CD 14L0%

8、1.6%0.7%0.8%无菌需氧菌 及苴葡阴性阴性阴性阴性厌氧菌 及貞菌阴性阴性阴性阴性支原体阴性阴性阴性阴性染色体核型分析符合规启符合规立符合规楚符合规左成卄成脂 诱目分化潜他符合规楚符合规定符合规符合规左端粒酶分析符合规楚符合规定符合规定符合规宦原癌基因、 抑癌基因检査符合规楚符合规定符伶规定符合规定表14 4 P2代种子细胞（批号:12802000011201000）长期稳定性实验研究结果检测项目检测时间0个月6个月12个月24个月细胞形态符合规楚符合规定符合规定符合规怎细胞活率92.8%92.9%924%913%细胞表 而抗原 分析CD 10599.7%100.0%99.9%99,4%

9、CD 7395.8%99.7%9698.1%CD 9099.9%100.0%100.0%99.5%CD 2999.8%99.8%100.0%99,4%CD 451J%1.1%1.0%0,9%CD79a/CD190.8%0.5%0.9%L0%第5贞 共3 3 2 2贞HLA-DR0.2%1.0%0.6%0.5%CD 340.6%0.5%1.5%0.2%CD 140J%1.2%0.5%07%无菌需氧菌 及苴菌阴性阴性阴性阴性厌氧菌 及貞菌阴性阴性阴性阴性支原体阴性阴性阴性阴性染色体核型分析符合规泄符合规宦符合规立符合规成骨成脂 诱导分化潜能符合规世符合规定符合规符合规左端粒酶分析符合规是符合规立符

10、合规立符合规左原癌基因、 抑癌基因检査符合规楚符合规定符伶规定符合规定表14 5 P2代种子细胞（批号:12802000171201000）长期稳定性实验研究结果检测项目检测时间0个月6个月12个月24个月细胞形态符合规主符合规定符合规追符合规宦细胞活率94 J %93.0%92.8%92.7%细胞表 而抗原 分析CD105997%99.8%99.6%99,8%CD 7399,9%974%99.8%99,4%CD 9099,9%99.9%100.0%99,9%CD 2997,2%99.9%100.0%99.9%CD 451.2%0.5%1.9%0.8%CD 79 a或CD191.0%1.5%1

11、.1%1.2%HLA-DR07%0.5%0.6%07%CD 341.0%04%1.0%1.1%CD 140.9%07%0.9%0,8%第6贞 共3 3 2 2页无菌需氧菌 及貞菌阴性阴性阴性阴性厌氧菌及貞菌阴性阴性阴性阴性支原体阴性阴性阴性阴性染色体核型分析符合规立符合规定符合规楚符合规定成骨成脂 诱导分化潜能符合规泄符合规定符合规立符合规宦端粒酶分析符合规是符合规定符合规定符合规怎原癌基因、 抑癌基因检査符合规立符合规定符合规楚符合规定1 1 5 5结论三批注射用人脐带间充质干细胞P2代种子细胞（批号12802000431201000,12802000011201000r 128020001

12、71201000） 24个月的长期稳定性试验研究结果表明:P2代种子细胞在液氮中冻存，放置24个月，各项检査指标均无明显变化，所有考察指标均在质量标准（草案）规定范 ffl 内。拟定贮藏的有效期为五年，后续的稳定性实验仍在进行中。2 2 P4P4代成品细胞稳定性实验研究资料及文献资料2.12.1样品批号及实验对应表格2 2丄1 1影响因素试验供试品：注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞（规格：2.0X107个/管）批号：12802000011401000表14-1注射用人脐带间充质干细胞影响因素试验样品批号及数据对应表格放置条件规格批次检测时间实验结果液氮一干冰（48小时2.0X107个/管

13、12802000011401000模拟运输温度变换2次表14-5模拟运输温度变换4次模拟运输温度变换6次第7贞 共3 3 2 2页2 2丄2 2加速试验供试品：注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞（5.0X107个/管）表14-2注射用人脐带间充质干细胞加速试验样品批号及数据对应表格放置条件规格批号检测时间（月）实验结果已完成-8(rC2C5.0X107个/ 管128020000114030000, 3. 6, 9表14-612802000011404000表14-712802000011405000表14-82 2丄3 3长期试验表14-3注射用人脐带间充质干细胞长期试验样品批号及数据对应

14、表格放置条件规格批号检测时间（月）实验结果已完成未完成液氮5.0X107个/管12802000011403000Or 3, 6. 9,1218. 24, 36 ,48, 60表14 912802000011404000表14-1012802000011405000表14-112.22.2考察方法及样品处理221221影响因素试验供试品：注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞（规格：2.0X107个/管）批次：12802000011401000第8贞 共3 3 2 2页选本品，冻存管包装，根据干细胞贮藏和运输的生物学特性，模拟本品发放前实际运输，贮藏条件，设定影响因素试验方案。样品从液氮罐中取出

15、后放入干冰中保存48小时后乂置于液氮中，反复多次，根据P4代成品干细胞质量检定标准（草案）,选取细胞形态，活率，无菌，细菌内毒素，支原体，细胞表面抗原等指标，考察本品在反复冻存下的质量，见表222222加速试验供试品：注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞批次：12802000011403000, 12802000011404000 r 12802000011405000新鲜制备的细胞，通过程丿了:降温，置于一8（rc2c的冰箱中长期冻存，拟放置12个月，于第0, 3个月，6个月，9个月，12个月取样，根据临床前注射用人脐带间充质干细胞成品细胞质量标准（草案），选取细胞形态，活率，无菌，细菌内

16、毒素,支原体，细胞表面抗原等指标作为 fi 点考察项U。223223长稳试验供试品：注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞批次：12802000011403000, 12802000011404000 r 12802000011405000取本品，冻存管包装，置于液氮中，分别于0, 3个月，6个月，9个月，12个月，18个月，24个月，36个月，48个月，60个月取样，按稳定性重点考察项U检测。根据临床前注射用人脐带间充质干细胞质量检定标准（草案），考察细胞形态,活率，无菌，细菌内毒素，支原体，细胞表面抗原等指标。2.32.3检验方法及限度标准检验方法详见注射用人脐带间充质干细胞临床申报资料1

17、1号。表i 4 4注 射 用 人 脐 带 间 充 质 干 细 胞P 4代 成 品 细 胞 临 床 研 究 用 质 量 标 准 （ 草 案 ）检测项目检测方法标准规泄【性状】细胞形态镜检细胞贴壁生长时，呈梭形，应为成纤维样细胞【检査】第9贞 共3 3 2 2贞细胞计数细胞计数仪检测法标示量的90%120%细胞活率细胞计数仪检测法不低于85%无菌需氧菌及真菌全自动细菌分枝杆菌 培养监测系统检测法阴性厌氧菌及克菌阴性支原体中国药典2010 04录XH B应符合规泄细菌内毒素中国药典2010版附录刈EV0 5EU/ml【鉴别】细胞 表面CD 90流式细胞术（FCM）不低于95%CD 73不低于95%第

18、10贞 共3 3 2 2贞2.42.4考察结果2.4.12.4.1影响因素试验供试品：注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞(规格20X107个/管，批号12802000011401000),结果见表14 5,图谱见附图2 12 15。表i牛5 P4代成品细胞(12802000011401000)影响因素试验结果温度变换细胞形态细 胞 活率无菌细菌 内毒素支原体流式检测CD (%)综合评价CD105CD73CD90CD29CD45CD34CD79 aCD19CD14HLADR2次符合规91 6%阴性V0.5EU/ml阴性99 999 3100.0100.01 2 0 60.12 01 6符合规

19、4次符合规定90.6%阴性V0.5EU/ ml阴性99 997.999 9100070 40.31 00 5符合规6次符合规902%阴性v0 5EU/ ml阴性99 89&999 999 90 7 0 81.00 80 9符合规24.224.2加速试验供试品：注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞(规格5.OX1O7个/管，批号12802000011403000 , 12802000011404000 ,14 614 8,图谱见附图2 162 60。12802000011405000 ) 结果见表第11DiDi共3 3 2 2贞表14 6 P4代成品细胞(128020000114030

20、00) -8(rC2C条件下加速试验结果时间(月)细胞形态无菌细菌 内毒素支原体流式检测CD (%)综合CD 105CD73CD90CD29CD45 :D34CD79iCD19CD14HLA-DR0符合规93,2%阴性v0 5EU/ml阴性99.69799 8971.50 8LIto0.7符合规3符合规92,0%阴性v0 5EU/ml阴性9&897 99&99870 50 40 40 70 6符合规6符合规93.5%阴性0.5EU/ml阴性99.399 499 59930 6L1LI0 70 6符合规9符合规92.0%阴性v0 5EU/ml阴性99 090299 699 70,

21、90 9LO0 80.6符合规表14 7P4代成品细胞(12802000011404000) 80929下加速试验结果时间(月)细胞 形态细胞活 率无菌细菌 内毒素支 原体流式检测CD(%)综合CD105CD73CD90CD29CD45CD34CD79a/CDI9CD14HLA- DR0符合 规定932%阴性vO 5EU/ml阴 性99798499.99&41.81 1L71 20 5符 合规3符合 规宦9L6%阴性vO 5EU/ml阴 性99398.09939941.10 90 41.00 7符 合规6符合 规定95阴性vO 5EU/ml阴 性99,795.199,899.71.20

22、 70,80.90 9符 合规9符合 规定924%阴性vO 5EU/ml阴 性9&783 799 699.80.50.40 50,80.8符 合规第贞 共3 3 2 2贞表14 8 P4代成品细胞（12802000011405000） 802下加速试验结果时间（月）细胞形态无菌细菌 内毒素支原体流式检测CD （%）综合评价CD 105 CD73CD90CD29CD4fD34CD79aCD19CDHHLA-DR0符合规92.9%阴性v0 5EU/mI阴性95.796499 496.0130 90.91 00.3符合规3符合规92.1%阴性v0 5EU/ml阴性9&99&6

23、9&99&90.60 70.60 40 6符合规6符合规91.3%阴性v0 5EU/ml阴性99.891.5100.0100,00.80 50 80.70 5符合规9符合规定93.5%阴性v0 5EU/mI阴性97.584599.599.60 7040 80.70 5符合规243243长期试验（液氮中）供试品：注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞（规格5.0X107个/管，批号12802000011403000 , 128020000II404000 ,14-914-11,图谱见附图2-61-2-114o表14 9 P4代成品细胞（12802000011403000 ）液氮保

24、存长期稳定性试验结果时间月细胞形细胞 活率无菌细菌 内毒素支原体流式检査（CD%）综 合CD 105 CD73CD90CD29CD45CD34CD79aCD19CD14HLA-DR0符合规93.2%阴性0.5EU/ml阴性99 6 97.199 897.11 50.8LILO0.7符 合规3符合规定91.5%阴性0.5EU/nil阴性99.799.799 799.70 40.70 50 70 7符 合规12802000011405000 ) o结果见表第12DiDi共3 3 2 2贞6符合规93.9%阴性0.5EU/ml阴性99.899 7100,099 80 40.80 910 5符 合规9

25、符合规92.3%阴性v0 5EU/ml阴性100.09&8100.0100.00 90 80 60 60 5符 合规12符合规90.6%阴性v0 5EU/ml阴性99.799.299.89940 00.50 7130 8符 合规表14-10 P4代成品细胞(12802000011404000 )液氮保存长期稳定性试验结果时间/J)细胞形态细胞 活率无菌细菌 内毒素支原体流式检测(CD%)综合评价CD105CD73CD90CD29CD45CD34CD79 aCD19CD14HL A-DR0符合规定93 2%阴性v0 5EU/m1阴性99 79&499.99&31.81 1

26、1.71.20 53 3符合规定92 5%阴性0 5EU/m1阴性97 599 797 597 40 40 10 40 50 5符合规定6 693 5%阴性0 5EU/m1阴性99 897 999 699 80 6L00 51.40 49 9符合规定92 5%阴性v0 5EU/m1阴性99 899 399 999 91.31 10 90 50 5符合规定1212符合规定904%阴性0 5EU/m1阴性99 695 299 899 70 90 61.10 70 5第13DlDl共3 3 2 2贞表14-11 P4代成品细胞(12802000011405000)液氮中保存长稳定性试验结果时间;)细

27、胞形态细胞 活率无菌细菌 内毒素支原体流式检测()综合评价CD105CD73CD90CD29CD45CD34CD79 aCD19CD14HL A-DR0符合规定92 9%阴性v0 5EU/m1阴性95 796 499 496 01.30 90 91.0033 392,5%92,5%阴性v0v0 5EU/ml5EU/ml阴性99 095 099 099 00.80 90 91.00.96 6923%923%阴性v0v0 5EU/ml5EU/ml阴性99 997 899 999 90 90 70 81.10 5符合定9 993.5%93.5%阴性v0v0 5EU/ml5EU/ml阴性99 799

28、799 799 71.00 80.80 50,71212符合规定90,1%90,1%阴性v0v0 5EU/ml5EU/ml阴性99 396 499 79&40 90 80 91.20 82 2 5 5讨论23.123.1影响因素试验影响因素试验结果表明：模拟干细胞运输贮藏温度变换条件，液氮一干冰(48反复改变贮藏温度次数对注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞的形态无细胞活率无明显变化，所有考察项U均符合质量标准的规定。三批注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞在温度一8(rC2C下保存9个月，加速试验的结果表明：样品形态无明显变化，细胞活率无明显变化，但随着保存时间的延长，细胞的表面

29、抗原分析结果出现下降的趋势，6个月，9个月的检测数据显示，个别流式指标a经不符合成品干细胞质量标准的限度要求，故本品在一8(rc2C下保存时间不宜超过6个月。2 2 5 5 3 3长期试验三批注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞在液氮中冻存12个月的长期稳定性实验研究结果表明：成品细胞的形态无变化，细胞活率无明显变化，细胞表面抗小时)影响,2 2 5 5 2 2加速试验第1 1 4 4贞 共3 3 2 2贞原分析结果有所波动，但所有变化均在较小的范围内，所有考察项U均符合质量标准 的规定。后续的稳定性考察实验仍在进行中。2 2 6 6考察结论山以上三批注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞的

30、稳定性考察结果可知， 液氮一干冰（48小时）反复改变运输贮藏温度6次，各指标依然符合质量标准（草 案）的规定，所以，贮藏温度的变换对本品的质量影响不大。温度对细胞的生物学活性有较大影响，在一8（rC2C加速条件下冻存，注射用 人脐带间充质干细胞P4代成品细胞表面抗原指标随着保存时间的延长呈现下降的趋 势，6个月，9个月的保存时间，个别指标已经不符合注射用人脐带间充质干细胞成 品细胞质量标准（草案）的要求，该温度不宜作为长期保存干细胞的适宜温度。液氮冻存条件下长期稳定性试验数据表明：在此贮藏条件下保存12个月，注射 用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞的稳定性较好，所有考察项14均在质量标准（草

31、案）规定的限度之内。根据以上试验结果，将本品的贮藏条件定为：液氮中保存，有效期暂定为五年。后续的长期稳定性研究实验仍在进行中。3 3注射用人脐带间充质干细胞在保存液中的稳定性实验研究冻存品按照本品申报资料10冻存细胞复苏操作的规定，室温复苏后，洗涤冻存 液，加入保存液4109贮存，12个小时内使用。临床釆用静脉滴注的方式，干细 胞悬浮在5%人血白蛋白复方电解质保存液中，使用剂量为5.0X107个/袋/成人。3.13.1样品批号及实验方案供试品：注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞批号：12802000011403000, 12802000011404000, 1280200001140500

32、0见下表I4-I2o表14 12成品细胞在保存液中稳定性研究实验方案批次放置条件检测时间点检测指标备注1280200001140300020代10025*00小时，6小时，12小时，18小时，细胞活率，细胞表面抗原分析表14-6-14-812802000011404000表14 1514 1712802000011405000表14-24-14-26第15UiUi共3 3 2 2贞3.23.2考察方法及样品处理选取三批P4代成品细胞（规格：5.0X107个/管），按照申报资料10第144章节所述操作，室温复苏，洗涤冻存液加入保存液，模拟临床包装，拟在2C, 4C,l（rc, 25C四个温度条件下贮藏18小时，并在0小时，6小时，12小时，18小时取样，参考成品干细胞制备及检定规程（草案）的规定，分阶段考察细胞活率，细胞表面抗原分析指标，观察在不同温度下保存液条件下细胞的保存效果和质量。3.33.3细胞活率考察结果考察项U应满足临床研究用注射用人脐带间充质干细胞P4代成品细胞质量标准（草案）的要求。结果见表14-13-表14 16。表14J3三批成品细胞保存液中稳定性考察细胞活率结果批号 细胞 活率取样 时间温度2r2r4r4rIOCIOC25r25r12802000011403000Oh9L5