基因工程基本操作程序知识总结

1、基因工程操作程序知识总结目的基因：指编码蛋白质结构基因基因文库基因组文库从基因文库中获取目的基因的获取方法部分基因文库人工合成PCR：是一项在生物体外复制特定DNA 片段的核酸合成技术。利用 PCR 技术扩增目的基因目的：获取大量的目的基因原理： DNA 复制过程基因表达载体的构建（基因工程的核心）目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下一代，并使目的基因能够表达和发挥作用。目的基因：基因表达载体的组成：启动子：目的基因：终止子：标记基因：转化：目的基因进入受体细胞内并在受体细胞内维持稳定和表达的过程将目的基因导入受体细胞方法：导入植物细胞的方法：农杆菌转化法基因枪法花粉通道法目的

2、基因的检测和鉴定外显子与内含子导入动物细胞的方法：显微注射技术导入微生物的方法：检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因检测：检测转基因生物的染色体上是否插入了目的基因方法：分子杂交技术（DNA 探针 +转基因生物DNA）检测目的基因是否转录方法：分子杂交技术（DNA 探针 +转基因生物mRNA）检测目的基因是否翻译成蛋白质方法：抗原抗体杂交鉴定：对生物进行个体水平的鉴定一般来说，结构基因都是由外显子和内含子组成，但是，外显子和内含子的关系不是完全固定不变的。有时同一条DNA 链上的某一段DNA 序列，当它作为编码某多肽链的基因时是外显子，而作为编码另一多肽链的基因时，则是内含子，结果是同一

3、基因可以同时转录为两种或两种以上的mRNA。2原核细胞的基因结构与真核细胞的基因结构的异同点原核细胞的基因真核细胞的基因不同点编码区连续；结构简单编码区有间隔，不连续；结构复杂都有编码区和非编码区；编码区都有调控遗传信息表达的核苷酸序列；编相同点码区上游都有与RNA 聚合酶结合的位点考点梳理（一） DNA 重组技术的基本工具1限制性核酸内切酶“分子手术刀”1）主要是从原核生物中分离纯化来的。2）功能：能够识别双链 DNA 分子的某种特定的核苷酸序列，并能将每一条链上特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键切开。（ 3）切割方式：在中心轴线两侧将DNA 切开，切口是黏性末端。沿着中心轴线切开DNA，

4、切口是平末端。2DNA 连接酶 “分子缝合针 ”1） DNA 连接酶的分类： E.coliDNA 连接酶和 T4DNA 连接酶。（ 2）作用及作用部位：E.coliDNA 连接酶作用于黏性末端被切开的磷酸二酯键，T4DNA连接酶作用于黏性末端和平末端被切开的磷酸二酯键。3运载体（运输工具） ：质粒、噬菌体和动、植物病毒等（ 1）必备的条件：能在受体细胞中复制并稳定保存；具有一至多个限制酶切割位点，供外源DNA 片段插入；具有标记基因，供重组DNA 的鉴定和选择；对受体细胞无害，不会影响受体细胞正常的生命活动。（ 2）常用运载体 质粒：裸露的，结构简单且独立于细菌DNA 之外的，具有自我复制能力

5、的小型环状DNA 分子。(二 ) 基因工程的基本操作程序1目的基因的获取： 直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA 文库，从中调用目的基因； 以 mRNA 为模板，反转录合成互补的DNA 片段，建立cDNA 文库； 利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段；化学合成。获得原核细胞的目的基因可采取直接分离，获取真核细胞的目的基因一般是人工合成，原因是原核生物基因中无内含子，而真核生物有内含子，在转录时要被剪切掉才能生成成熟的 mRNA，动、植物中内含子的剪切方式不一样，如果用直接分离的基因将无法表达；而人工合成的基因是没有内含子的。2 基因表达载体的构建重组质粒的构建1

6、）表达载体的组成：复制原点+目的基因 +启动子 +终止子 +标记基因复制起始位点即控制复制起始的位点。原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。而真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。启动子： 位于基因的首端的一段特殊的DNA 片断，是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质，但启动子本身不被转录终止子： 位于基因的尾端的一段特殊的DNA 片断，能终止mRNA 的转录目的基因中的标记基因最少要有2 个， 1 个是用来检测运载体是否进入了受体细胞，另一个是用来检测目的基因是否被拼接到运载体上；第一个标志基因要保证其完整性，能够进行表达， 若受体细胞表现出

7、该基因所控制的性状，说明运载体已进入受体细胞；第二个标志基因是插入目的基因的部位， 由于目的基因的插入破坏了其结构，不能表达其所控制的性状，若受体细胞没有表达出第二个基因所控制的性状，说明目的基因已进入受体细胞。常用的标记基因是抗生素基因。?2）构建步骤：用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有黏性末端的切口。用，产生相同的黏性末端。将切下的目的基因片段， 插入到质粒的切口处， 再加入适量 DNA 连接酶， 使质粒与目的基因结合成重组质粒。3将目的基因导入受体细胞）受体种类不同，导入方法不同受体细胞种类方法植物细胞（ 1）农杆菌转化法：目的基因插入Ti 质粒的T-DNA农杆菌 导入植物细胞稳定维

8、持和表达（ 2） 基因枪法（ 3） 花粉管通道法动物细胞显微注射法：目的表达载体提纯取卵（受精卵）显微注射 受精卵发育 新性状动物2+合 感受态细胞吸收DNA 分子2）受体种类不同，所用的受体细胞种类也不相同。植物：可以是卵细胞（受精卵） 、体细胞（可经组织培养成为完整个体）动物：受精卵（因为体细胞的全能性受到严格限制）3）转化实质：目的基因整合到受体细胞染色体基因组中4目的基因的检测与表达 首先要检测转基因生物的染色体DNA 上是否插入了目的基因，方法是采用DNA 分子杂交技术。 其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA，方法是采用标记的目的基因作探针与mRNA 杂交。最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行抗原抗体杂交。有时还需进行个体生物学水平的鉴定。如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。（三）蛋白质工程1实质：根据蛋白质的结构与功能之间的关系，通过改造基因，以定向改造天然蛋白质，甚至创造自然界不存在的、具有优良特性的蛋白质。2基本原理：预期蛋白质功能测定蛋白质三维空间结构 推测应有的氨基酸序列 找到对应的脱氧核苷酸序列（基因） 具有预期功能的蛋白质3应用1）通过改造酶的结构，有目的地提高蛋白质的热稳定性。2）合成嵌合抗体。3）改变蛋白质的活性。