植物组织中丙二醛含量的测定

1、植物组织中丙二醛含量的测定实验六逆境下植物细胞膜脂过氧化产物TBARS的提取与含量测定活性氧(reactive oxygen species, ROS)是机体在生化反应中产生的性质活泼 的具有极 强的氧化功能、可以导致机体衰老的物质。自由基的形成有生化、化学、物理等多方面的因素，但主要是来自机体内的生 化反应，如各种酶的催化反应等都可以产生大量自由基。此外，一些化学物质空气 污染、辐射、运动和心理压力等都会激发活性氧和自山基的产生。机体在氧的利用 过程中，会因各种内因性和外因性因素而产生各种活性氧和自山基，这些自山基在 维持机体正常代谢中起到积极的作用。2-生物体内的自由基主要包括超氧阴离子)

2、、疑自由基(0(?0H)、氢自由基(H?)、有机自1由基(R?)、单线态氧(0)、过氧化氢(H0)、臭氧(0)及脂类过氧化自由基(L00?) 和脂2223类自由基(L?)等。为维持机体的正常功能，抵御各种活性氧和自111基对器官和组织的伤害，体内 有各种清除活性氧和自山基的抗氧化物质，如抗氧化酶类、蛋口质类和抗氧化维生素 等。抗氧化酶类主要包括超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH- Px)、谷 胱甘肽转移酶(GRT)等，这些酶是机体内部的笫一道防线，但会随着年龄 的增长而下降;蛋口质类包括铁传递蛋白、肝球蛋口、血红素结合蛋口等;抗氧化维 生素有维生素C、尿酸

3、、a-VE, a-胡萝卜素，卩-胡萝卜素。当活性氧和自山基浓度超过生理限度时，多余的自山基成为有害物质，攻击脂 质、蛋白质、糖类和脱氧核糖核酸等大分子物质，发生各种氧化反应，引发各种 氧化损伤，进而导致细胞结构和功能的变化，使机体抵抗力下降，从而导致各种疾 病发生，如人体癌症、动脉硬化、心脑血管疾病、肝肾损伤、糖尿病、缺血再灌流 障碍等多种疾病。氧化是导致疾病的主要原因之一。如植物受到高温、水渍、低温 等不良环境时，从形态上也表现出一系列症状，如萎嫣，叶片变黃，生物量变小 等，以及保护酶活性下降等。为了了解生物体的健康状况，有必要对膜脂过氧化产 物MDA进行测定。一、实验目的1. 重点掌握MD

4、A测定的原理和测定方法。2. 了解丙二醛（MDA ）在生物体形成的因素。3. 进一步熟悉和掌握分光光度计和离心机的使用方法和注意事项。二、原理植物器官在衰老或逆境条件下，生物膜中的不饱和脂肪酸与自III基发生过氧化 反应，使膜中不饱和脂肪酸含量降低，导致膜的流动性下降，透性增大，使膜的正 常功能遭到破坏。,MDA是膜脂过膜脂过氧化分解的终产物之一是丙二醛（malondialdehyde MDA ） 氧化作用的最终分解产物，其含量可以反映膜脂过氧化的程度，而且其在生物 体内积累还会对膜和细胞造成进一步的伤害，所以MDA的含量可以反映生物体衰老 和遭受逆境伤害的程度。测定原理：丙二醛在酸性和高温条

5、件，可以与硫代巴比妥酸（TBA ）反应生成红 棕色的三甲川（3,5,5 三甲基恶醴2, 4-二酮），在532 nm处有最大光吸收， 在600 nm处有最小光吸收，据此可测定MDA。可溶性糖干扰该反应，糖与TBA的反应产物在532 nm处也有吸收，但最大吸收波长在450 nm,为了消除糖类物质 对MDA-TBA反应的干扰，可用下列公式消除山糖类引起的误差。C （ u mol/L ） = 6. 45 （ A 532 , A 600 ）, 0. 56A 450 式中：A 450、A 532和A 600分别表示450 nm、532 nm和600 nm处的吸光度值。算出植物 样品提取液中MDA的浓度后，

6、可进一步算出其在植物组织中的含量。三、实验材 料、试剂与仪器设备（-）实验材料植物的根或叶片，校园里3种柏科植物爬地柏、侧柏、圆柏。（二）试剂1. 10%三氯乙酸（TCA ）。2. 0. 5%硫代巴比妥酸（TBA ）溶液:称取硫代巴比妥酸0. 5g溶于10 , TCA 溶解并用其定容至100 mL。（三）仪器设备研钵，恒温水浴锅，分光光度计，离心机，天平，刻度试管，移液管四、实 验步骤1. MDA的提取与显色称取植物材料0. 2g-0. 5 （根据材料的受伤害程度），剪碎，加入2 mL 10% TCA 和少量石英砂，研磨至匀浆，再加3mL TCA进一步研磨，匀浆转移至试管中，加 入5mL的TB

7、A将试管放入沸水浴中煮沸10 min（自试管内溶液中出现小气泡开始计时），取 出试管并冷却，3000 r/min离心15 min ,取上清液并量其体积。2. 以不加样品为对照0.6 , TBA溶液为空白测定532 nm、600 nm和450 nm 处的吸光度值。五、结果计算MDA浓度(mol/L),提取液体积(ml), MDA含量(P mol/g)二样品重量(g), 1000注意事项：1. 0. 1-0. 5%的三氯乙酸对MDA-TBA的反应较合适，若高于此浓度，其反应液 的非专一性吸收偏高。2. MDA-TBA的反应的加热时间，沸水浴控制在1015mino时间太长或太短均 会引起532nm的吸光度下降。作业1. 比较你测定的植物在不同的环境条件(或不同植物在同一逆境下)，植物组 织中MDA含量，并分析其原因，2. 测定MDA含量有何意义，3. 简述植物组织中MDA含量测定的原理,并说明哪些因素干扰MDA含量测定， 应如何消除。4. 让学生阅读两篇参考文献赵世杰；许长成；邹琦；孟庆伟。植物组织中丙二醛测定方法的改进。植物生 理学通讯.1994陈贵；胡文玉；谢甫绑；张立军.提取植物体内MDA的溶剂及MDA作为衰老指 标的探讨.植物生理学通讯.1991.陈贵；张立军.植物体内址DA含量单位与计算方法的一些问题.植物生理学通