血吸虫试剂盒主要原材料研究资料

1、血吸虫抗体快速检测试剂盒主要原材料的研究资料1血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA）（试剂盒检测点原料）（1）制备方法：取人工感染1500条日本血吸虫尾蚴45d的家兔肝脏，用生理盐水洗净后经高速捣碎机捣碎，分样筛分离除去肝脏组织，沉淀离心，收集分离虫卵，依次经200目和300 目尼龙绢过滤，收集滤渣，即为较纯净的血吸虫虫卵。然后加入10倍量的生理盐水，置玻璃匀浆器内制成匀浆，用超声粉碎机超声处理（1min×10次），液氮冻融3次，最后以10 000 r/ min 离心30 min ，上清液即为血吸虫可溶性虫卵抗原（SEA），经0.22um超滤膜过滤除菌后分装，20冻存备用。（2）抗原性测定a

2、测定方法1) 取抗原200 µl加入比色杯内，用分光光度计测定A280和A260OD值；2) 将抗原用pH9.6碳酸盐缓冲液作1:4、1:8、1:16、1:32、1:64稀释,分别包被于酶标板内(100ul/孔),37 3小时；然后倾去抗原液,用洗涤液洗涤3次,每次5分钟；BSA（0.5mg/ml)为对照，同法操作；3) 加样：分别加已作1:100稀释的血吸虫抗体检测质控品、阳性和阴性对照血清各100 µl，空白孔仅加 100 µl稀释液。置于湿盒内， 37 培育30 分钟；4) 洗板：取出酶标板，甩去孔内液体，每孔注满洗涤液洗涤 5 次，每次均需停留30秒后再甩

3、净拍干；5) 加酶标结合物：除空白对照孔外，每孔加入酶标结合物2 滴，37培育30分钟；6) 洗板：同3；7) 显色：每孔加底物和显色剂各1滴，混匀，37避光反应10分钟，加终止液1 滴，混匀，判断结果。b判断依据：1) 根据公式计算：样品浓度（mg/ml）=（1.45×A280-0.74×A260 ）×稀释倍数；2) 肉眼观察：不加终止液观察，基本无色或微蓝色为阴性，呈明显蓝色为阳性；3) 仪器判断：酶标仪上450nm读取OD值，待检样本孔的OD值大于阴性对照2.1倍者为阳性。c结果 抗原OD值A280nm 2.1510 抗原OD值A260nm2.5121计算公

4、式抗原浓度（mg/ml）=（1.45×A280-0.74×A260 ）×稀释倍数；抗原浓度1.26mg/ml比值 SEA阴参阳参血吸虫抗体检测质控品阳参血吸虫抗体检测质控品1:4 0.05 0.45 0.15 9.03 3.08 1:8 0.04 0.51 0.17 10.26 3.48 1:16 0.05 0.52 0.19 10.31 3.78 1:32 0.05 0.49 0.18 9.41 3.52 1:64 0.06 0.61 0.24 10.92 4.35 BSA 0.01 0.04 0.01 0.82 0.11 结论：浓度为1.26mg/ml，经倍比

5、稀释，用于ELISA检测血吸虫抗体阳性临界血清，1:64(0.02mg/ml)仍呈阳性结果，具有高度的免疫原性,可用于血吸虫抗体检测（3）工作浓度：SEA 的作用是作为检测点，包被于硝酸纤维素膜上，用于检测人血清中特异性抗血吸虫抗体。因此，其工作浓度的选择对于检测效果的评价是试剂盒研制的关键技术。如果浓度过高，阳性反应色度过强，易产生假阳性结果；反之，浓度过低，则不易辨别，影响检测的灵敏度。所以，研究目的是选择能较清晰产生反应色度的最低抗原浓度。方法：a. SEA抗原原液浓度测定：以紫外分光光度法测定SEA抗原原液A280和A260OD值，根据公式计算浓度（mg/ml）=1.45×A

6、280-0.74×A260 ；b. SEA稀释：以0.02 mol/L pH8.0 PBS将SEA从1:2至1:10 稀释成9个稀释度，与原液一起分成10个浓度组。c. 包被：将上述10个浓度的SEA分别点膜，在每块空白反应板中的硝酸纤维素膜（德国Schleicher & Schuell Bioscience，孔径0.45um）上点滴1ul，每个浓度组包被3块，室温干燥2小时后加入2滴封闭液（主要成分为牛血清白蛋白），待干。 d. 效果测试：分别在上述10个浓度组的金标反应板中央小孔内滴加2滴洗涤液，渗入后于反应板中央加25 µl 血吸虫抗体检测质控品（参照血吸虫病

7、抗体诊断试剂国家参考品低感染度血清(P13)制备，方法见附页），待液体充分吸入，加2滴洗涤液，渗入后分别加3种浓度的显色液（即金标二抗，浓度依据A520OD值确定，制备方法见后），每块反应板加1种浓度的显色液，每种显色液均加4滴，最后加2滴洗涤液，渗入后根据检测点颜色深浅判断效果。结果：a. SEA抗原原液OD值：A280为2.1510，A260为2.5121 ，根据公式（mg/ml）=1.45×A280-0.74×A260计算，浓度为1.26 mg/ml。b. 检测效果金标二抗浓度SEA抗原稀释度原液1:21:31:41:51:61:71:81:91:101.2+

8、7;1.0+±±0.8+±±±±±-注：色度判断：+深，+易见， ±浅，-无c. 最适工作浓度选择：金标二抗浓度在1.2 （A520值）时所有金标反应板的背景较深，且制备成本高；0.8时，检测效果较差；1.0时的检测效果最好，在抗原稀释度1:8（0.157mg/ml）仍可清晰显示检测点。因此，抗原最适工作浓度为1:51:8范围内（约0.2±0.05mg/ml），而金标二抗的最适工作浓度为1.0（A520值）。进一步验证试验：以0.2mg/ml工作浓度的SEA抗原为检测点，1.0（A520值）金标二抗为显色

9、液研制的血吸虫抗体快速检测试剂盒（斑点免疫金渗滤法），采用中国药品生物制品检定所提供的“血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品”（ 批号：20041108）作为测定血清。其中阴性参考品由15份正常人血清组成，血吸虫病抗体均为阴性，用于测定试剂盒的特异性。阳性参考品由15份强、中、弱阳性血清组成，用于测定试剂盒对血吸虫病抗体阳性血清的检出能力。最低阳性检出参考品为1份血吸虫病抗体阳性样品，从1:21:16作倍比稀释，用于测定试剂盒的最低检出量（灵敏度）。诊断试剂的精密性测定由1份中等阳性血清组成，重复检测10次，用于测定试剂盒的精密性（操作方法同1 (3) d ）。结果：血清份数阴性(数)阳性(数)符合

10、率（%）阴性参考品15150100阳性参考品15015100精密度参考品10010100灵敏度参考品1:2+(1份)1:4+(1份)1:8±(1份)1:16-(1份)2金标二抗（试剂盒显色液原料）（1）制备方法：a. 胶体金制备采用鞣酸-柠檬酸钠还原法，胶体金颗粒直径为20 nm。具体方法为：取1%氯金酸5ml溶于395 ml dH2O，加热至60 ，快速加入鞣酸-柠檬酸钠溶液100 ml（1%柠檬酸三钠20 ml，1%鞣酸0.05 ml，dH2O 80 ml），加热煮沸15 min，溶液颜色由黑逐渐变为亮红色。冷却后用0.1 mol/L碳酸钾调溶液pH至8.0。b金标二抗制备二抗为

11、亲和层析法纯化的羊抗人IgG(上海神航生物科技有限公司，蛋白浓度为3.34mg/ml，批号：IP2030)。最适蛋白稳定量选择：将待标记的二抗分别加到 1ml胶体金溶液中，另设一管不加蛋白质的对照管，分钟后加入0.1ml 10NaCl溶液，混匀后静置小时观察结果，红色不变者为能使胶体金稳定的蛋白量，再加20即为最适标记蛋白量。反应结果见下表：试管123456胶体金1ml1ml1ml1ml1ml1ml二抗0 ul1 ul1.5 ul2 ul2.5 ul3 ul10%NaCl0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml0.1ml颜色蓝浅蓝灰浅红红红从反应结果观察，5号管（2.5ul）颜色未变

12、，2.5ul×120%=3 ul，再乘以二抗的蛋白浓度3.34mg/ml，则最适蛋白稳定量为0.01mg/ml胶体金。在500 ml胶体金溶液内加入5mg 二抗，磁力搅拌30 min，依次加入1% PEG20000 20ml和5% BSA 80 ml，继续搅拌10 min，20 000 r/min 离心20 min，沉淀物用PB缓冲液（0.02 mol/L，pH8.0）洗涤，再以20 000 r/min 离心20 min，沉淀物用金标稀释液（0.02 mol/L，pH8.0 TBS）稀释至A520nm为0.8、1.0、1.2等3种浓度，过滤除菌。（2） 最适工作浓度选择：分别用以上3

13、种浓度的金标二抗检测已包被不同浓度抗原的检测点，根据检测点颜色深浅和背景清晰度判断效果，操作方法同1 (2) d。（3）结果：同1 (3) b, c，金标二抗浓度在1.0时的检测效果最好，在抗原稀释度1:8（0.157mg/ml）仍可清晰显示检测点。继对“血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品”进行测定，进一步验证了这一工作浓度的显色效果（见1（4）。3. 人IgG（试剂盒质控点原料）（1）制备方法：采用辛酸提取法，从健康献血者5ml血清中提取人IgG。经0.22um超滤膜过滤除菌后分装，2ul/支，置冻干机抽成干粉，-20保存。临用时每支加工作浓度的0.02 mol/L pH8.0 PBS缓冲液复溶

14、即可。（2）活性测定a.测定方法1) 取人IgG 10 µl加190µl生理盐水作1:20稀释后加入比色杯内，用分光光度计测定A280和A260OD值；2) 将样品用pH9.6碳酸盐缓冲液从1:6400起倍比稀释14个滴度,分别包被于酶标板内(100ul/孔),373小时；然后倾去液体,用洗涤液洗涤3次,每次 5 分钟；BSA（0.5mg/ml)为阴性对照，同法操作；3) 加酶标结合物：除空白对照孔外，每孔加入酶标结合物2 滴， 37 培育 30 分钟；4) 洗板：取出酶标板，甩去孔内液体，每孔注满洗涤液洗涤 5 次，每次均需停留30秒后再甩净拍干；5) 显色：每孔加底物和

15、显色剂各 1滴，混匀，37 避光反应10 分钟，加终止液 1 滴，混匀，判断结果。b判断依据：1) 根据公式计算：人IgG浓度（mg/ml）=（1.45×A280-0.74×A260 ）×稀释倍数；2) 肉眼观察：不加终止液观察，基本无色或微蓝色为阴性，呈明显蓝色为阳性；3) 仪器判断：酶标仪上450nm读取OD值，待检样本孔的OD值大于阴性对照2.1倍者为阳性。c结果：人IgG OD值A280nm 2.8619 人IgG OD值260nm1.7831计算公式人IgG浓度（mg/ml）=（1.45×A280-0.74×A260 ）×稀

16、释倍数；人IgG浓度56mg/ml人IgGOD值比值人IgGOD值比值1:64002.56867551.37351:16384000.01990.3979961:128002.50180450.036071:32768000.013580.2715961:256002.11549742.309941:65536000.003660.0731981:512001.2928525.856991:131072000.009180.1835981:1024000.61812912.362581:262144000.006110.1221981:204800.3102796.2055821:524288

17、000.005520.1103991:4096000.097321.946396BSA0.013540.27081:8192000.05911.181997空白-0.00069-0.0138d结论：原液浓度为56mg/ml，从1:6400起作倍比稀释，经ELISA方法检测，最低检测浓度为1:204800(0.3g / ml),与抗人IgG的结合力强,可用作斑点免疫金渗滤法质控点。（3）工作浓度：人IgG的作用是作为质控点，包被于硝酸纤维素膜上，能够与金标二抗结合，产生红色圆点，以此判断金标二抗处于有效期内；如不能出现红色圆点，则金标二抗失效。因此，试验目的就是选择能清晰产生反应色度的人IgG浓

18、度。a.方法：1) 人IgG原液浓度测定：以0.02 mol/L pH8.0 PBS将原液作1:20稀释，用紫外分光光度仪测定 A280和A260OD值，根据公式2计算浓度（mg/ml）=（1.45×A280-0.74×A260）×稀释倍数；2) 以0.02 mol/L pH8.0 PBS将人IgG原液从1:100至1:1000 稀释成10个稀释度。3) 包被：将上述10个浓度的人IgG分别点膜，在每块空白反应板中的硝酸纤维素膜（德国Schleicher & Schuell Bioscience）上点滴0.5ul，每个浓度组包被1块，室温干燥2小时后加入2

19、滴封闭液，待干。 4) 效果测试：分别在上述10个浓度组的金标反应板中央小孔内滴加2滴洗涤液，渗入后于滴加4滴显色液（即金标二抗，浓度1.0（A520值），最后加2滴洗涤液，渗入后根据检测点颜色深浅判断效果。b. 结果：1) 人IgG作1:20稀释的OD值：A280为2.8619，A260为1.7831 ，根据公式（mg/ml）=（1.45×A280-0.74×A260）×稀释倍数计算，原液浓度为56 mg/ml。2) 检测效果金标二抗浓度人IgG稀释度1:1001:2001:3001:4001:5001:6001:7001:8001:9001:10001.0+&

20、#177;±±±注：色度判断：+深，+易见， ±浅c. 最适工作浓度选择：人IgG在工作浓度1:600至1:100（约0.1mg/ml0.6 mg/ml）均能清晰显示红色圆点，均可作为判断金标二抗是否有效的质控点。但因实际用量极微（每只反应板仅需0.5 ul）, 最适工作浓度选择1:300(0.19mg/ml)为宜。参考文献1 毛守白主编.血吸虫生物学与血吸虫病的防治.北京：人民卫生出版社，1990：465.2 现代免疫学实验技术（第二版），湖北科学技术出版社，2002年3 丁建祖,干小仙,沈慧英,等.快速检测抗日本血吸虫抗体的金标免疫渗滤法的建立及应用J. 中国寄生虫病防治杂志,1998,11 (4) :308-3104 辛晓芳,张谨,薄淑英, 等.血吸虫病免疫诊断试剂的质量评价J.中国血吸虫病防治杂志,2006,18(2):119-121.附：血吸虫抗体检测质控品制备方法本品参照“血吸虫病抗体诊断试剂国家参考品” （ 批号：20041108）低感染度抗体水平(P13)制备，作为斑点免疫金渗滤法试剂盒出厂检验的质控品。具体方法：将2 ml血吸虫病阳性血清（江西省