张亚平,蛋白质组技术.

1、有文.张亚萍什么是蛋白质组?蛋白质组 邙厂0匕00）由澳大利亚学者Wilkins 和Williams等于1994年提出，指的是由基因组编码的 全部蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织乃至细 胞的全部蛋白质。与以往的蛋白质化学的研究不同， 蛋白质组研究的对象不是单一或少数的蛋白质，它着 重的是，需要获得体系内所有蛋白质组分的物理、化学及生物学参数，如分子量、等电点、 表达量等。它是动态的,有它的肘间性、可调节性； 进而能够在细胞和生命有机体的整体水平上阐明生命 现象的本质和活动规律。主要方法-蛋白质分离技术凝胶双向电泳、HPLC；蛋白质鉴定技术Edman测序、质谱技术；图像分析与生物信息图像分析

2、软件，数据库；相互作用研究技术酵母双杂交技术、免疫共沉淀、蛋白质芯片等。常规蛋白质组学研究技术双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及 质谱技术被称为蛋白质组研究的三大基本支撐技术.蛋白质组研 究的技术路线如下图：XL俎饭.律波EdmanM:1|ESI/MS/MSPSDA1ALDI/ TOF/MS111MALDI/TOFAfS N*序列送白活力長白定伎双向凝胶电泳一、双向凝胶电泳的原理二、双向凝胶电泳技术操作的基本过程三、双向凝胶电泳过程中需要注意的问题（一）、双向凝胶电泳的原理等电聚焦（Isoelectric focusing, IEF） 蛋白质是两性电解质 在等电聚焦中蛋白质总

3、是向与英等电点和 同的pH位置移动并停留在此位置上 等电点相同的蛋门质都聚焦在与等电点相 同的pH位置上+ / 一夕/ -SDS-PAGE十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离了去 污剂，带大量的负电荷SDS与蛋白质结合，其所带负电荷大 人超过蛋白质所带电荷量，消除了不同蛋 白之间所带电荷的差异SDS-PAGE中，蛋口质迁移率只与蛋口 质的分子量有关先根据蛋白质的等电点不同，利用等电 聚焦进行第一向分离，将等电点相同的蛋 白质集中在与等电点相同的pH区再以与等电聚焦成90度角的方向进行 SDS-PAGE第二向分离，将等电点相同的 蛋白质再按分子量大小彼此分开以此将复杂蛋白混合物中的蛋白质在二 维平

4、面上以点的形状分离。蛋白质双向凝胶电泳是各种蛋白质分 离分析方法中唯一能同时分辨上个蛋白 质点的技术蛋口质组学研究中主耍的分离技术SOS- W E用碗佞电总pH3D二）、双向凝胶电泳技术操作的棊本过程提取蛋白样品，进行样品的预处理进行第一向等电聚焦电泳等电聚焦后的胶条经过平衡转移到第二向凝胶上，与等电聚焦呈垂直 方向进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳用银或考马斯亮蓝染色，经双向凝胶电泳 图像分析软件进行凝胶图像分析找出差异表达的蛋白质点样品制备solubilization of the proteins样品制备中遵循以下原则:样本制备步骤尽可能简单，以避免不必要的蛋白质损失；裂解细胞或组织的方法应尽

5、可能减少蛋白酶解(proteolysis) 或降解(degradation)；;避免反复冻融样本。样本于双向电泳前新鲜制备及溶解； 去除样本中的脱氧核糖核酸(DNA ),核糖核酸(RNA ),脂 质等；在样本加入尿素后避免加热；蛋白质提取一般使用含有变性剂、表面活性剂、还原剂、定pH梯度缓冲液(IPG buffer)o提取的主要方法是对细胞、组织等样品进行破碎、溶解. 失活或还原，尽可能断开蛋白质间的连接键,再采用三氯乙 酸与冷丙酮联用来沉淀提取全部蛋白质。第 向：变性的等电聚焦电泳，根掀蛋 门质的等电点进行分离二向：SDS衆内烯酰胺电泳.根 据蛋n质分片尿进行分离(三)、双向凝胶电泳过程中需

6、要注意的问题1 双向凝胶电泳结果的可重复性蛋门质样品制备是关键1) 尽可能地使蛋白质组中的各种蛋白质成分都溶解在裂解液中2) 防止制备过程中蛋口成分的降解与修饰3) 要保证蛋白质彻底变性4) 取材要有重现性：用细胞不用组织5)裂解液中需加：尿素断裂蛋口质的氢键和疏水键还原剂破坏蛋白质中的二硫键兼性离了去垢剂增加疏水性氨基酸残基的 溶解性6)整个制备过程需在低温环境中进行，在 裂解液中加入蛋白酶抑制剂用固相pH梯度等电聚焦(IPG)防止阴极飘移，pH梯度不稳定载体两性电解质在电场中依据其等电 点形成pH梯度，这种pH梯度因阴极飘移而 不稳定，缺少重现性。IPG中的pH梯度是凝胶聚合过程中通 过酸

7、性和碱性丙烯酰胺缓冲液形成的，是 稳定的双向电泳屮的等电聚焦选用IPG2.凝胶中蛋白质的染色同位素；"同位素是目前己知最灵敏的蛋白质染 色方法同位素是在细胞代谢过程中掺入蛋白质 的，不同蛋白质掺入的同位素量不同，因 此同位素强度不能代表蛋白质的实际丰度同位素标记的蛋白质不能直接用丁后续 的鉴定实验银染色.；T银染色是除同位素外最灵敏的染色方法 只需110ng蛋白质即可显示岀条带。酸性的硝酸银染色法更适合酸性蛋口的 染色，碱性的银氨染色法对碱性蛋白质的灵敏 度稍高双向电泳的染色（银染）考马斯亮蓝染色考马斯亮蓝R-250为三苯基甲烷，考马 斯亮蓝G-250为二甲花青亮蓝R-250LLG-

8、250的灵敏度稍高，lOOng左右蛋 白质即町显示出条带，G-250更适合染色小 分子多肽方法简便，是最常用的染色方法脱色后的蛋白质样品可用于质谱分析等 后续研究双向电泳的染色（考马斯亮蓝染色）非共价修饰的荧光染料女口 Sypro red 利 I Sy pro orange 灵敏度可与银染媲美 方法简单，一步染色，无需脱色样品可直接用于序列测定和质谱分析锌“铜负染 I I I I I I 、 I凝胶背景为不透明的乳白色或青绿色， 蛋白斑点则是透明的灵敏度介于银染和考马斯亮蓝染色之间染色对后续分析的干扰较小冃前在蛋白质组研究屮经常将两种染色方法结合使用；先经银染分析确定有意义的蛋白斑点， 再加大

9、上样量，重作电泳，用考马斯亮蓝 染色纯化的样品经脱色后进一步进行质谱鉴 定聲异凝胶电泳(Differential gel electrophoresis )备a柚按物i 用站一种熒粉记Min世期由电肚2、质谱仪的基本组成1. 气体扩散2. 直接进样3. 气相色谱1电子轰击2化学电离3场致电离4激光 1单聚焦2双聚焦 3. E行时间4 四极杆质谱图意义g8070eo1QO2 a 10* CUM rtUTWT2001667 7I600 aoo iOOO 4200 1400 1600 f BOO 2000 2200竹任|B |A:离子的相对强度(Y axis)B:离子的质量与电荷比(m/z, X a

10、xis)C：质谱图中最强的峰称为基峰(base peak)D:相对于特定的检测器时称为峰的绝对强度E:所有质谱峰对应的是离子电信号强度和离子应在m伍位賈而非真实的离子强度和离子.F:样状谱(centroidal peak)G:离斯峰(gauss peak)基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)(1 )主要技术基质辅助激光解吸电离(Matrix-assistedlaser desorption/ionization, MALDI)技术线性飞行时间质量检测器(time of flight, TOF)MALDI原理:m之吸少质 7n品罷了 33样基吸当 也一，只充 影键$ 刖基关分程

11、 “ 9 誓的品过 -F 陆吸技形 二 鬻电气幕 邮这霍负 监用分醤 系Q聲正 鳳质将呈 轟基时聖 敦同譚电化書朋 岛子气庠 尼母分并盘 黠使分赛 骼移部显 證转大¥ ti 擴荷：gim事3 嬴 II 刎浣4wla» 鳖发 嚮间>» «*«TOF原理离子源中每一脉冲激光产 生的离子先经过一不加速 电场，获得动能，再进入 一个高真空无电场飞行管 道.离子在此无电场飞行 管道内以在加速电场获得 届速度飞行。斎量较整场 离子飞行 摆检测器厂崔重的离子飞 行速度慢，莪晚到払检测快，较早到心/夬慢，较晚到达检测 器.离子的飞存时间与其 测定咖创比,

12、I酵母双杂交扌支术一、酵母双杂交系统的原理二、酵母双杂交系统的操作程序三、酵母双杂交系统的应用酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system) 也叫相互作用陷阱(Interaction trap)由Fields和Song于1989年建立 用于研究细胞内蛋白质与蛋白质间的相互作用。(一) 、酵母双杂交技术原理酵母双杂交系统的建立基于对真核牛物转录 激活因子结构与功能的认识真核生物转录激活因子DNA结合结构域转录激活结构域BDAI)J1«组件式：结构可互相分开功能互相独立空间较近时表现活性 中间序列对活性无影响147AABDC端213AA酵母转录因子GAL4LexA蛋白单

13、纯疱疹病毒的VP编码区BDAD大肠杆茵的LexA蛋白AD选择酵母细胞作为双杂交系统的 宿主菌株：1 酵母细胞具有翻译后加工功能2酵母细胞令很多的营养缺陷型标记，筛选 阳性克隆比较方便、容易。3酵母细胞有性生殖形成二倍体细胞，转化 容易，转化率高构建两种可力人肠杆菌和酵母细胞中复制的 穿梭质粒载体1. zmpr基因大肠杆曲筛 选标记2Trp、Leu-酵母筛选标 记3. X与BD以融合妥白形 式表达，Y与AD以舷合 妥白表达报告基因在GAL4结合的顺式作用元件下游需连接报告 基因。目询应用最多的报告基因是LacZ基因，表达 后能在XG“1培养基上产生蓝色菌落。其次是His基因，表达后能使酵母菌金缺

14、少组 氨酸的培养基中生长。现在多提倡两种报告基因同时应用，颜色筛 选和营养缺陷筛选同II寸进行，以降低假阳性的出 现XBD启动子报告基因酵母双杂交原理示意图（二）、酵母双杂交系统的操作程序 1 构建X蛋白表达质粒将X蛋白基因与BD质粒重组，转化 大肠杆菌，用Amp抗性标记筛选阳性克隆, 测序验证，并通过SDS-PAGE和Western Blotting检测融合蛋白。 2构建Y蛋白表达质粒或预转文库 如丫蛋白是已知蛋白，则将丫蛋白基因 与AD质粒重组。如丫蛋白是未知蛋白，则 需用AD质粒构建cDNA文库。要求文库含 有足够的转化子，数量在107以上，保证文 库内含有研究者所感兴趣的蛋白。 3.从

15、大肠杆菌屮提取两种重组质粒共转 化酵母细胞 在缺少Trp、Leu和His,含有X-gal 的培养基上筛选在此培养基上生长的蓝色菌落证 明X蛋白和丫蛋白能互相作用。酵母的接合型a接合型a接合型-单倍体 二倍体 单倍体DNA-BD载体 DNAAD载体|转化1转化X和Y蛋白相互作用X基因与DNz-BD质粒重纽Y基因与DNA-AD质粒重俎I分别转化大肠杆苗Amp培养基XBD重组质粒亠'YAD重组质粒J7转化酵母细胞Trp和I疋u营养缺陷培养基ITrp、Leu. His营养缺陷培养基X-gal蓝色前落无菌曹生长! 1X和Y妥白相互作用X和Y妥白间无作用（三）、酵母双杂交系统的应用 1检测两种己知蛋白质Z间/E体内是否存 在相互作用.这是酵母双杂交系统最基木用 途 将两种已知蛋白质的编码基因分别 克隆到BD载体和AD载体上，共同转染酵 母细胞。若报告基因得到表达，则证明两 种蛋白质之间在细胞内存在相互作用。 2.筛选与己知蛋白质相互作用的新的蛋 白质。 这是酵母双