总RNA的提取测定及逆转录

1、总RNA的提取及测定（Trizol法）（1）组织匀浆 取出高温高压消毒后研钵， 切取 50-100mg 冰冻组织置于研钵内， 倒入液 氮，研至粉末状。 每 50-I00mg 匀浆组织标本加入 lml 的 Trizol 继续研磨。（标本的量不能超 过Trizol体积的10%,否则会出现DNA污染。） 将以上匀浆标本转移到1.5ml的EP管中，在15-30E放置5分钟，以彻 底分离核蛋白复合体。 （或 -70°C 过夜后再进行）（2）相分离加入0.2ml的氯仿，加盖好后用手剧烈摇荡巧秒，在 15-30E放置2-3分 钟，然后4C离心12000g, 15分钟。离心后分成3层，下面的红色为酚

2、-氯仿 相, 一个中间层（DNA和蛋白质），上层是无色的水相。RNA只存在于水相中。 水相占总Trizol的60%。RNA沉淀将上层水相转移到另一干净的1.5mlEP管中，加入0.5ml异丙醇，轻柔上 下颠倒混匀，15C-30C静置10分钟，然后4C, 12000g离心10分钟。在管 的侧壁和底部可看到絮状胶样沉淀，这就是 RNA沉淀。RNA洗涤弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，轻弹管壁使RNA沉淀漂浮，4C, 7500g 离心 5 分钟。（5）RNA再溶解去上清，置真空或空气中5-10分钟，干燥RNA沉淀，（不能在真空中离心 干燥。注意不能将RNA沉淀完全干燥，这样会极大地降低它

3、的溶解度。）根据 RNA的量，用DEPC*（ 20-60卩l）重悬RNA沉淀，用枪头反复吹打几次，静 置 10分钟。测定RNA浓度：2卩l DEPC水 2次调零。2卩l样品测其RNA浓度。A260/A280的值在1.8-2.0 范围视为纯度很高。（RNA于-70° C保存）逆转录(RT)取2卩g总RNA加入1卩l随机引物，用DEPC水补充体积为15卩I70° C反应5分钟，置于冰上。加入以下反应体系：5XM-MLV逆转录缓冲液5ulM-MLV(200U/ ul)1ul4xdNTP(10mol/L)l.25ulRNas in (40U/ ul)0.6ulDEPC水2.25ul

4、总反应体积25ul 置于PCR扩增仪中25T 10分钟，37C60分钟，95C 5分钟终止反应。逆转 录产物加80ul灭菌ddH20混匀并分装，于-20C保存。PCR及琼脂糖凝胶电泳PCR反应体系：TakaRaExTaqDN 聚合酶0.25 ul0.25 ul10XReaetion Buffer5 ul5 ul4XdNTP4 ul4 ulPrimer11 ul0.6 ulPrimer21 ul0.6 ul待测cDNA1 ul1 ul火菌ddH2O37.75 ul38.85 ul总体积50 ul50 ul2%琼脂糖凝胶电泳鉴定产物是否为特异目的片段：称取琼脂糖0.6g放入200ml三角烧瓶中，加

5、入30ml 1xTBE溶液，加热令其 完全溶解，待冷却至约60°C时加入2ul溴化乙锭溶液(10mg/ml)，浇板，水平放 置，避光待凝。将已制备的2%琼脂糖凝胶放入电泳槽，加入 1xTBE至高出凝胶表面1mm。10 u1 PCR产物分别和 2 ul 6x加样缓冲液混匀后上样电泳，另取6ul DNALadderMaker作为DNA片段大小的对照。80V-120V电压下电泳20-30分钟。所需试剂（1）RNA（2）（3）（4）1（ 5）RNA提取试剂 TRIZOL Invitrogen 公司焦碳酸二乙酯（DEPC： Sigma公司（进口分装） 氯仿异丙醇75%乙醇：无水乙醇加DEP（水配制（6）核糖核酸酶抑制剂（RNAsin）：华美生物工程公司（7）随机引物：上海生工生物工程公司（8）dNTP：北京天为时代公司（9）M-MLV逆转录酶：Promega公司（10）M-MLV逆转录缓冲液（11）DEPC水（12）TakaRaExTaq DNA聚合酶：宝生物工程有限公司（13）目的基因引物：上海生工生物工程公司（14）（15）T< （17）（18）10*Reaction BufferdNTP：北京天为时代公司灭菌ddHO 琼脂糖：上海鼎国生物工程公司（