美国药典微生物检测精要x

1、美国药典微生物检测精要美国药典微生物检测精要USP微生物章节概要微生物章节概要2022-2-6微生物专家委员会的责任范围微生物专家委员会的责任范围n微生物测试n微生物监控n不负责不负责p水水p个论（除了设立微生物限度、无菌和细菌内个论（除了设立微生物限度、无菌和细菌内毒素标准）毒素标准）2022-2-64药典论坛（药典论坛（PF）n药典论坛（PF）的出版社提供了对USP和NF进行公共评审和审议的机会，同时提供了一个论坛，就标准和分析方法的开发和修订交换意见和信息。n药典论坛（PF）出版提议供公共评审和评议nPF是免费开放的是免费开放的2022-2-6微生物学是开发、生产及成品微生物学是开发、生

2、产及成品测试的一部分测试的一部分n无菌控制也适用于非无菌产品n控制贯穿于一个药物或生物制剂从研发控制贯穿于一个药物或生物制剂从研发到市场到成品控制的整个过程到市场到成品控制的整个过程n整个过程中的各种微生物控制的整合将提高最终产品微生物的质量保证nUSP提供了每个阶段微生物控制程序和提供了每个阶段微生物控制程序和指导指导2022-2-6作为重要组成的微生物控制作为重要组成的微生物控制n原料和组分的微生物控制n环境的微生物控制环境的微生物控制n生产过程的微生物控制n成品的微生物控制n人员人员的微生物控制n所有所有微生物控制的组合2022-2-6原料和组分的微生物控制的原料和组分的微生物控制的US

3、P观点及文件观点及文件n非无菌制剂的微生物检查：微生物计数测试n非无菌制剂的微生物检查：特定微生物的检验n非无菌制剂的微生物检查：特定微生物的检验2022-2-6环境微生物控制的环境微生物控制的USP观点及文件观点及文件n洁净室和其他受控环境的微生物洁净室和其他受控环境的微生物评估评估n消毒剂与杀菌剂n无菌产品包装-完整性评估2022-2-6过程微生物控制的过程微生物控制的USP观点及文件观点及文件n灭菌与无菌保证灭菌与无菌保证n生物指示剂n灭菌-化学和物理指示剂，及综合指示剂n生物指示剂-耐受力测试2022-2-6成品微生物控制的成品微生物控制的USP观点及文件观点及文件n无菌测试无菌测试n

4、细菌内毒素测试细菌内毒素测试n热源测试n抗菌有效性测试n最终灭菌物品-参数放行n无菌产品包装-完整性评估2022-2-6微生物章节微生物章节n防腐剂防腐剂-有效性有效性n生物指示剂生物指示剂 耐受力测试耐受力测试n非无菌产品的微生物检查：微生物测试n控制菌的微生物检查n无菌测试n细菌内毒素测试n灭菌生物指示剂2022-2-6微生物章节微生物章节n消毒剂与杀菌剂消毒剂与杀菌剂n非无菌产品的微生物评估n水分活性应用n洁净室和其他受控环境的微生物评估n微生物实验室规范n无菌产品包装-完整性评估2022-2-6微生物章节微生物章节n无菌测试无菌测试-隔离系统验证隔离系统验证n无菌-化学和物理化学指示剂

5、，及综合指示剂n灭菌和无菌保证n最终灭菌药品-参数放行n微生物方法验证n药物的微生物回收率验证2022-2-6微生物章节微生物章节n制药用水n微生物计数测试微生物计数测试-营养和食品补充营养和食品补充剂剂n控制菌的微生物检查-营养和食品营养和食品补充剂补充剂n非无菌营养和食品补充剂的微生食品补充剂的微生物评估物评估2022-2-6部分通则概览部分通则概览n过程控制过程控制/验证验证生物指示剂耐受力测试生物指示剂耐受力测试灭菌生物指示剂水环境监控2022-2-6部分通则概览部分通则概览n成品参数放行无菌测试微生物限度防腐剂效力测试2022-2-6部分通则概览部分通则概览n通用指导原则通用指导原则

6、消毒剂和杀菌剂说法活性的应用微生物实验室规范微生物方法验证2022-2-6生物指示剂生物指示剂-耐受力测试耐受力测试n该通则针对生产商。该通则针对生产商。n详细描述了如何确定D值和进行芽孢制备物的质量控制2022-2-6灭菌生物指示剂灭菌生物指示剂n该通则针对最终用户n分章节描述生产商和用户对指示剂性能的评估n“自制备”章节芽孢富集制备耐受力特性评估的仪器使用过程验证的生物指示剂使用2022-2-6过程控制过程控制n水水n环境控制2022-2-6制药用水制药用水n大量的修改包括有关的流程图：大量的修改包括有关的流程图：水系统验证周期制药用水制药用水的选择n大量的章节关于水的微生物监控-方法、鉴

7、别、警报和控制限2022-2-6环境控制环境控制n洁净室的微生物评估n根据2005年度的提议是要求重写该通则2022-2-6参数放行参数放行nUSP最终灭菌药品最终灭菌药品-参数放行参数放行灭菌周期必须经验证其灭菌保证水平SAL达到10-6 验证过程的物理及微生物参数生物指示剂和物理指示剂的使用要求有变更控制系统对不同的灭菌模式2022-2-6无菌测试无菌测试n两种测试方法两种测试方法膜过滤法直接接种法2022-2-6无菌测试无菌测试-隔离系统验证隔离系统验证n隔离器设计和建设隔离器设计和建设n隔离系统验证n包装完整性验证n隔离器环境的无菌保持n无菌测试结果解释n培训与安全2022-2-6微生

8、物限度微生物限度n主要内容主要内容微生物计数控制菌检查微生物评估2022-2-6USP VS EP微生物限度nEP/USP MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS:MICROBIAL ENUMERATION TESTSnEP/USP MICROBIOLOGICAL EXAMINATION OF NONSTERILE PRODUCTS: TESTS FOR SPECIFIED MICROORGANISMSnEP/USPACCEPTANCE CRITERIA FOR PHARMACEUTICAL PREPARATIONS AND SUB

9、STANCES FOR PHARMACEUTICAL USE2022-2-6抗菌有效性测试抗菌有效性测试n用于证明多剂量产品在其使用过程中能用于证明多剂量产品在其使用过程中能够经住来自微生物方面的挑战够经住来自微生物方面的挑战n大量的接种，对接种物频繁的取样测试其存活情况2022-2-6抗菌有效性测试抗菌有效性测试106CFU/ml每种微生物，共 培养5种微生物10倍系列稀释 浇平皿计数测定存活率第第7、14、21、28天取样天取样确定减少情况，确定减少情况，采用log表示2022-2-6良好的微生物实验室规范良好的微生物实验室规范n使实验室引起的数据可变性最小化使实验室引起的数据可变性最小化

10、n提供一些对微生物数据评估的指导2022-2-6微生物替代方法验证微生物替代方法验证n描述微生物测试的种类n验证参数定量测试定性测试n提供验证准则和研究设计建议2022-2-6微生物回收率验证微生物回收率验证n重要重要-证明方法适用性证明方法适用性n范围防腐剂的中和平皿计数的准确率u辨析下限u上限微生物实验室规范微生物实验室规范2022-2-6微生物实验室规范微生物实验室规范n重要的控制点重要的控制点无惧技术培养基控制菌种控制设备操作与控制数据记录与评估实验室布局和运作员工培训等2022-2-6无菌技术无菌技术l防止和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作方法和管理方法无菌环境灭菌消毒卫生要求无

11、菌操作技术2022-2-6培养基培养基n培养基制备n培养基储存n培养基质量控制2022-2-6培养基制备培养基制备l微生物实验室中，工作质量的核心是培养基l根据既定的目的选用正确的培养基l生产商的CoA和说明书配制储存菌种选用l水纯化水，去离子水，蒸馏水记录用量2022-2-6培养基制备培养基制备n成分的称量校准过的天平清洁的容器和工具记录称量n不要过度加热加热帮助溶解，通常培养基变深色说明过度加热添加剂加入后需充分混合2022-2-6培养基制备培养基制备n清洁的玻璃器皿防止外来污染和抑制剂玻璃器皿清洁2022-2-6培养基制备培养基制备n灭菌条件供应商提供参数，或自己验证高压蒸汽灭菌，过滤除

12、菌验证应考虑无菌，和培养基生长能力湿热灭菌要考虑装载分布，通常121 15minu注意加热速度过慢会使培养基过度加热保证最低SAL，在无菌和过度加热之间的平衡与污染物灭菌分开消毒锅灭菌结束后，不建议在其中储存，不正确的加热、灭菌条件会影响（颜色、澄清、pH、凝固能力、促生长能力、选择性）2022-2-6培养基储存培养基储存n制备培养基的储存，注意琼脂培养基易受冷冻的影响，不宜低于0 ，凝胶结构破坏避光、避热琼脂培养基密封，防止水分蒸发2022-2-6培养基储存培养基储存n融化重复融化应被限制（不超过1次），防止过度加热或潜在污染融化时，使用u水浴或流通蒸汽u微波炉，热板要防止过度加热融化的培养

13、基的储存u在40-45 水浴不应超过8hu浇制平皿前擦干防止污染2022-2-6培养基储存培养基储存n培养基应标示批号，制备批号制备日期，有效期培养基名称n有效期确定根据成分，配方，容器，储存条件等确定生长能力试验数据支持n培养基储存不得超过有效期2022-2-6培养基储存培养基储存n培养基应根据生产商的说明书，并在验证过的条件下储存n重要区域环控用培养基必须双重包装最终灭菌，否则进行全数预培养及用前检查n应根据当地生物危险品安全程序处置过期培养基2022-2-6培养基质控测试培养基质控测试n所有待用培养基应检查：生长能力l每批制备的培养基均需进行l测试菌种根据药典，供应商说明书及环境分离得到

14、的菌株l生长能力测试不合格u调查u不得使用该批号2022-2-6培养基质控测试培养基质控测试n灭菌后培养基检查：无菌pH，+/-0.2容器/平皿的完整性抑制或指示能力n定期稳定性检查以确认储存有效期2022-2-6微生物菌种保藏微生物菌种保藏l建立标准程序处理、保藏菌种，防止污染和特性变化l必须小心的处理l使用前确认菌种的身份，纯度l根据生产商说明书复苏菌种，使用接种技术l-70 以下或冷冻干燥保存储备菌种，可延长保存周期l开启后不要重新冷冻菌种，剩余部分应弃置l传代次数（每接种一次即为一代）不超过5代2022-2-648微生物菌种保藏微生物菌种保藏长期保藏菌种l使用菌种保藏技术l按照供应商指

15、导进行原始菌种复苏l如果是在液体培养基中，离心取得菌悬液，按1：20加入新鲜的保藏培养基，加入培养基20%的无菌甘油l如果是从斜面上，移入10%甘油肉汤l分散后，分装入无菌小瓶，液氮或其他方法-50 保藏2022-2-649实验室设备维护实验室设备维护n绝大部分实验室设备需要进行标准的验证（IQOQPQ）n定期校准，保养n定期进行性能检查n根据设备的特征和使用状况确定频率灭菌锅，去热源烘箱，层流台/生物安全柜，培养箱，pH计，冰箱，空气取样仪n定期清洁、消毒2022-2-650实验室布局和运作实验室布局和运作n实验室的布局应该有利于实验室的运作防止交叉污染活动分区无菌，环控样品的处理和培养应在

16、无菌环境中进行注意安全n实验室应通过不同的进入通路和隔断来区分“洁净”区和“阳性”区，包括更衣，清洁，消毒；洁净区的生物安全柜仅用于无菌和洁净的操作n当样品发现微生物生长，后续的工作应转移至“阳性”区2022-2-651实验室布局和运作实验室布局和运作n在无菌条件下小心地对物料进行取样n环控培养基应在待取样区域环境中放入环控设备并小心的操作n无菌隔离装置技术的使用可能是有效的2022-2-652样品处理样品处理n大部分样品，水或环控样品中的微生物对操作、储存环境敏感产品处方，容器材质，储存时间/温度n减少样品取样与测试间的间隔时间并控制储存条件n远距离的转移需要确认转移条件对测试及样品的影响n

17、在无菌条件下，使用无菌及技术取样，即使是非无菌样品n取样记录样品信息，取样日期，送样时间，人员/部门，实验室样品接受及确认2022-2-653培养基培养时间培养基培养时间n培养时间短于3天，用小时表示30-35 培养18-72小时培养指定的最短时间，当超过培养时间时，进行良好的微生物结果判断n培养时间长于3天，用天表示20-25 培养3-5天从上午或下午，培养至结束当天的相同的时间段，进行结果判断2022-2-654人员培训人员培训n制药企业的微生物实验室人员应该接受过微生物学或相关健康科学的正规学习（在校学习）相关SOP的培训被赋予保持其技术和经验的职责n 程序SOP应易于理解并作为培训计划

18、的基础SOP的编号或标题提供了一个便利的将培训文件化的方法n每个岗位应有相应培训要求，进行上岗前的资质确认2022-2-655人员培训人员培训n绩效评估应定期进行应证明人员在实验室核心活动中的能力n微生物实验室管理人员应经过适当的教育与培训管理、计划、预算、安全、调查技巧、技术报告编写、相关SOP等微生物技术水平应不低于其管理的技术人员了解微生物学原则、能科学地解释法规及指南有足够的微生物知识及经验提供技术指导2022-2-656实验室资源实验室资源n保证实验室有足够的资源完成要求的测试熟悉预算管理n制定实验室绩效的考核指标实验室调查数量接受样品与样品开始测试的时间间隔测试结束与报告完成的时间

19、间隔.2022-2-657文件文件实验室文件至少包括1.微生物人员培训和能力确认（上岗资质）2.设备验证、校准和维护3.测试中的设备性能（如温度记录）4.培养基制备、无菌检查、生长能力测试、选择性测试5.培养基清单与控制6.根据程序进行测试的主要参数7.数据和计算的确认8.经QA人员或相应领导审核过的报告9.超标结果调查2022-2-658实验室结果的维护实验室结果的维护nSOP应写明测试的实际工作流程n记录重要的测试步骤及参数，用于确认结果的完整性，并能为重复测试提供信息n至少应包括：日期测试样品微生物检验人员的名字程序编号测试结果偏差（如有）测试参数（设备，菌种，培养基）管理人员审核签名2

20、022-2-659实验室结果的维护实验室结果的维护n设备重要设备记录在测试记录上校准计划适用的话，有使用记录重要的温度记录（水浴，培养箱，灭菌锅）应该具溯源性2022-2-660实验室结果的维护实验室结果的维护数据纠错错误的地方划一横线，签名和日期测试结果应包含平皿计数结果数据分析的方法应罗列在相关的SOP中对粘贴的图表、数据，骑缝签名存档记录应存档并防止丢失应有记录存留计划2022-2-661测试结果解释测试结果解释n微生物数据有时不容易解释：与人类相关的微生物群落被广泛的用于许多测试人员污染是始终被关心的问题样品或环境中的微生物并非均匀分布微生物检测可变范围大：可能在+/-0.5lg单位左

21、右u因此，得到的结果与预期的结果略有差异并不是重大的问题2022-2-662测试结果解释测试结果解释n避免污染非常重要n结果必须从广泛的微生物视觉去解释：可能的污染物的情况产品中微生物存活的可能微生物的生长特性（尤其是真菌孢子的散布，生长）2022-2-663测试结果解释测试结果解释n对不符合的结果进行调查通常会发现，不合格由以下2个原因之一造成的：-实验室错误-产品不符合n无论哪种情况，管理层必须立即被通知2022-2-664测试结果解释测试结果解释n调查包括：1.数据偏离的程度（严重性？）2.平行数据间差异的评估3.实验室环境4.取样方法5.物料的特性（存活的污染微生物）6.人员面谈7.留

22、样的评估8.测试过程2022-2-665测试结果解释测试结果解释n纠偏计划如果发现实验室错误，需要纠偏措施的有效性需要跟踪和记录n无效测试由于错误，将试验视作无效必须记录n确认测试（复试）应有SOP描述何时进行确认测试非无菌制剂的微生物检查：非无菌制剂的微生物检查：微生物计数测试微生物计数测试2022-2-6介绍介绍n在此描述的测试允许对在需氧条件下生长的嗜温细菌和真菌进行定量计数n这些测试设计用于确定原料药或制剂是否符合已建立的微生物质量标准。当用于这样的目的时，按下列指导进行，包括取样数量，结果诠释。n该方法不适用于将微生物作为活性成分的产品。n其它可替代的微生物程序，包括自动化方法，如果

23、已证明了其同药典方法的等效性，也可以使用。2022-2-668个论中的典型的微生物限度的要求个论中的典型的微生物限度的要求nMicrobial Enumeration Test and test for Specified Microorganisms : The total aerobic microbial count does not exceed 1000cfu/g, the total combined molds and yeasts count does not exceed 100cfu/g, and it meets the requirement of the test f

24、or absence of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa and for absence of Escherichia coli and Salmonella species.2022-2-669常规过程常规过程n避免产品以外的微生物污染（最大的污染源是什么？）n去除细菌抑制/真菌抑制性（为什么？）n证明表面活性的无毒性与其与抑制剂的相容性2022-2-670计数方法计数方法薄膜过滤法孔径0.45um的滤膜，选择不受样品液干扰的材质，不对微生物的截留产生影响，建议每片薄膜上的样品量为1g，过滤后适当冲洗薄膜平皿计数：平皿浇注法

25、9cm的平皿，加入1ml样品液，15-20ml培养基，浇制温度45，每种培养基每个稀释度至少2个平皿，可使用更大规格的平皿平皿计数：表面涂布法9cm的平皿，加入45左右15-20ml培养基，待凝固，每种培养基每个稀释度至少2个平皿，样品涂布不少于0.1ml，可使用更大规格的平皿最大可能计数法（MPN）用于检测极少数量的微生物，精密度、准确度差，不适用于霉菌2022-2-671生长能力测试和方法适用性生长能力测试和方法适用性n生长能力测试包括生长能力测试包括n一般考虑n测试菌株准备n缓冲液n阴性对照n培养基生长测试n计数方法适用性包括计数方法适用性包括n样品制备n接种与稀释n中和/去除抗菌活性n

26、产品存在情况下的微生物回收率n结果与解释2022-2-672生长能力测试和方法适用性生长能力测试和方法适用性n“必须建立在待测产品存在生物情况下，仍有检出微生物能力的方法”n“如果测试性能发生变化或发生可能影响测试结果的产品变更，方法适用性必须重新进行再确认”2022-2-673生长能力测试和方法适用性菌株生长能力测试和方法适用性菌株2022-2-674MicroorganismPreparation of test stainGrowth PromotionSuitability of Counting Method in the Presence of ProductTotal Aerob

27、ic Microbial CountTotal Yeasts and Molds CountTotal Aerobic Microbial CountTotal Yeasts and Molds CountStaphylococcus aureus such as ATCC6538, NCIMB 9518, CIP 4.83, or NBRC13276Soybean-Casein Digest Agar orSoybean-Casein Digest Broth 30 -3518-24 hoursSoybean-Casein Digest Agar 100 cfu 30 -35 3 daysS

28、oybeanCaseinDigest Agar/MPNSoybeanCaseinDigest Broth 100 cfu 30 -35 3 daysPseudomonas aeruginosa such as ATCC 9027,NCIMB 8626, CIP 82.118, or NBRC 13275Soybean-Casein Digest Agar or Soybean-Casein Digest Broth 30 -3518-24 hoursSoybean-Casein Digest Agar 100 cfu 30 -35 3 daysSoybeanCaseinDigest Agar/

29、MPNSoybeanCaseinDigest Broth 100 cfu 30 -35 3 daysBacillus subtilis such as ATCC6633, NCIMB 8054,CIP 52.62, orNBRC 3134Soybean-Casein Digest Agar or Soybean-Casein Digest Broth 30 -3518-24 hoursSoybean-Casein Digest Agar 100 cfu 30 -35 3 daysSoybeanCaseinDigest Agar/MPNSoybeanCaseinDigest Broth 100

30、cfu 30 -35 3 days2022-2-675MicroorganismPreparation of test stainGrowth PromotionSuitability of Counting Method in the Presence of ProductTotal Aerobic Microbial CountTotal Yeasts and Molds CountTotal Aerobic Microbial CountTotal Yeasts and Molds CountCandida albicans such as ATCC10231,NCPF3179, IP

31、48.72, orNBRC 1594Sabouraud Dextrose Agar or SabouraudDextrose Broth202523 daysSoybeanCasein DigestAgar 100 cfu3035 5 daysSabouraud Dextrose Agar 100 cfu2025 5 daysSoybeanCasein Digest Agar 100 cfu3035 5 daysMPN: not applicableSabouraud Dextrose Agar 100 cfu2025 5 daysAspergillus niger such as ATCC1

32、6404,IMI149007,IP 1431.83, orNBRC 9455Sabouraud Dextrose Agar or PotatoDextrose Agar2025 57 days, or until Good Sporu-lation is achievedSoybeanCasein DigestAgar 100 cfu3035 5 daysSabouraud Dextrose Agar 100 cfu2025 5 daysSoybeanCaseinDigest Agar 100 cfu3035 5 daysMPN: not applicableSabouraud Dextros

33、e Agar 100 cfu2025 5 days2022-2-676测试菌种及阴性对照测试菌种及阴性对照n微生物使用不超过5代n2小时内使用，如2-8不超过24hn黑曲霉及枯草芽孢杆菌也可制备孢子悬浮液，2-8保存期限需确认n阴性对照必须没有微生物，测试失败需要进行调查2022-2-677培养基生长能力测试培养基生长能力测试n测试每批“待用”培养基，每批从干粉培养基制备得到的培养基，及根据配方制备得到的培养基n按上述表中的条件培养TSA/TSB 30-35 ，沙堡葡萄糖琼脂20-25 细菌：3d，真菌5dn结果判断：固体培养基：偏差系数为2液体培养基：有明显生长，与前次测试结果一致2022-

34、2-678计数方法的适用性计数方法的适用性n计数方法适用性章节包括样品准备，接种，稀释，中和抗菌活性和在产品存在的情况下的回收率，结果和解释的方面的讨论2022-2-679样品制备样品制备n样品制备方法依据待测产品的物理特性。如如下述的个程序均被证明不适用，必须开发适用的替代方法水溶性产品水不溶性非脂类产品脂类产品气雾剂皮肤贴剂2022-2-680测试样品数量测试样品数量n除非其他地方指出，用10g或10mln气雾剂：10个容器n皮肤贴剂：取10片n随机抽样，混合测试2022-2-681测试样品数量（活性成分）测试样品数量（活性成分）下列情况，活性成分可减少测试数量：n毎剂量单位的数量1mgn

35、每g或每ml（不以剂量单位表示的制剂）小于1mg样品数量不得少于10个剂量单位或，10g或10ml产品含有的活性成分下列情况下，活性成分可减少测试数量：样品数量有限制或批量太小（例如，小于1000ml或1000g）样品数量为批量的1%，除非更少的用量被规定或被证明，并被官方认可2022-2-682测试样品数量（制剂）测试样品数量（制剂）n批量小于200的制剂：样品量可降至2个单位，或1个单位（批量小于100）2022-2-683产品检测产品检测n样品培养：nTAMC: 30-35 ,3-5dnTYMC: 20-25 ,5-7d非无菌制剂的微生物检查：非无菌制剂的微生物检查：特定微生物的检验特定

36、微生物的检验2022-2-6介绍介绍n样品培养：n下述检验方法用于在规定条件下测定指定的微生物是否存在。n该测试设计用于确定一种原料药或制剂是否符合已建立的微生物质量质量标准。当用于这样的目的时，按下述的指导进行，包括取样数量，结果诠释。n可替代的微生物程序，包括自动化方法，如果已证明了其同药典方法的等效性，也可以使用。 2022-2-686个论中的典型的微生物限度的要求个论中的典型的微生物限度的要求nMicrobial Enumeration Test and test for Specified Microorganisms : The total aerobic microbial co

37、unt does not exceed 1000cfu/g, the total combined molds and yeasts count does not exceed 100cfu/g, and it meets the requirement of the test for absence of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa and for absence of Escherichia coli and Salmonella species.2022-2-687常规过程常规过程n避免产品以外的微生物污染（最大的污染

38、源是什么？）n去除细菌抑制/真菌抑制性（为什么？）n证明表面活性的无毒性与其与抑制剂的相容性2022-2-688产品测试产品测试n通则分别列出了各个微生物测试的章节，每个章节包括以下这些通用部分：样品制备和增殖选择性培养结果解释2022-2-689培养基适用性测试培养基适用性测试和方法适用性测试和方法适用性测试n培养基适用性测试：测试菌株准备缓冲液阴性对照生长能力测试，抑制及选择性测试n方法适用性包括方法适用性包括样品制备接种与稀释中和/去除抗菌活性产品存在情况下的微生物回收率结果与解释2022-2-690菌种、阴性对照及培养基菌种、阴性对照及培养基n菌种微生物使用不超过5代2小时内使用，如2

39、-8不超过24h生孢梭菌也制备孢子悬浮液，2-8保存期限需确认n阴性对照必须没有微生物，测试失败需要进行调查n测试每批“待用”培养基，每批从干粉培养基制备得到的培养基，及根据配方制备的培养基，根据药典确认相应培养基具有适当的特性2022-2-691质控可接受标准质控可接受标准n生长能力测试液体培养基与前一批通过测试并被批准的培养基结果一致固体培养基-清楚观察到与前一通过测试并被批准的培养基的前次结果一致n抑制性应无测试微生物生长n指示能力菌落外观和指示反应与前一通过该测试并被批准的培养基的前次结果一致2022-2-692方法适用性方法适用性n如果对某个微生物的抗菌活性不能去除，那就假设这个被抑

40、制的微生物不会出现在产品中2022-2-693解释解释鉴别：n菌落生长说明存在这通过鉴别测试确认n什么类型的鉴别测试n适量的培养基：1:10稀释的含有1g或10ml样品液加入至适量的TSB中如何知道何为适量？非无菌药用制剂非无菌药用制剂及物料微生物可接受标准及物料微生物可接受标准2022-2-6介绍介绍n非无菌制剂中存在的微生物可能降低药物的治疗作用，甚至使之消失，并可能对患者的健康产生不良影响。n生产厂家必须按GMP的指导进行药品的生产，储存和分发，以保证最终产品中仅带有低水平的微生物。药物产品的微生物质量标准药物产品的微生物质量标准2022-2-6剂型TAMC (cfu/g or cfu/

41、ml)TYMC (cfu/g or cfu/ml)控制菌（1g或ml）非液体口服给药制剂103102大肠埃希菌液体口服给药制剂102101大肠埃希菌直肠给药制剂103102-牙龈、皮肤、鼻及耳用102101金黄色葡萄球菌铜绿假单孢菌阴道制剂102101金黄色葡萄球菌铜绿假单孢菌白色念珠菌吸入剂102101金黄色葡萄球菌铜绿假单孢菌耐胆盐革兰阴性菌活性药物成分，辅料1031022022-2-698控制微生物测试控制微生物测试沙门菌大肠埃希菌铜绿假单孢菌金黄色葡萄球菌白色念珠菌生孢梭菌耐胆盐G- 的定性及定量没有其他的有害微生物吗？2022-2-699药物产品的微可接受标准药物产品的微可接受标准除

42、上述表中的微生物，其他需要检查的微生物的重要性应根据下述评估“产品用途（眼，鼻等）产品特点：支持生长？或防腐剂？应用的方法药物接受者：对婴儿、幼儿及衰弱患者的风险存在疾病、伤口、器官损伤相应因素的风险评估有经授权的有资质的人员进行2022-2-6100FDA说什么？说什么？ 无有害微生物无有害微生物n21 CFR 211.113微生物污染控制（a）适当的书面程序必须建立并遵循以防止非无菌药品中的有害微生物2022-2-6101还有什么？还有什么？n21 CFR 211.165分发前的测试与放行（b）必须的话，对每批应不存在有害微生物的药品应有适当的实验室测试 不仅仅是不存在USP规定的微生物2

43、022-2-6102有害微生物有害微生物n有害微生物的概念不适合用于无菌产品，无菌产品中不得有任何微生物无菌产品中不得有任何微生物n将用于非无菌产品的微生物测试，及非无菌生产环境中分离得到的微生物评估及清洁验证2022-2-6103有害微生物有害微生物n有害微生物可以被定义为：a)能在产品中增殖的微生物，对药品的物理特性及治疗作用有负面影响，并且b)由于产品中微生物的数量及致病性能导致使用该药品的患者受到感染2022-2-6104有害微生物有害微生物显而易见的药品的有害微生物举例：在含有普通防腐剂的局部用霜剂、鼻腔喷剂或口服液中能够增殖的假单胞菌，片剂的表面生长的真菌食源性的致病细菌，如口服制

44、剂中的沙门菌和志贺菌暴露与高湿环境中的气泡眼包装内的片剂表面会生长真菌2022-2-6105有害微生物有害微生物洋葱伯克氏菌洋葱伯克氏菌需氧的非芽孢杆菌。存在于水中，土壤及植物中，如水果和蔬菜。伯克菌伯克菌属中有两种常见人体致病菌，洋葱伯克氏菌及类鼻疽伯克氏菌。洋葱伯克氏菌是患有囊肿性纤维化和慢性肉芽肿疾病的患者体内重要的呼吸道致病菌。以前属于假单胞菌属。2022-2-6106有害微生物有害微生物铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌考虑到其感染数量和感染类型，及有关的发病率和死亡率，它是假单胞菌属中最重要的人体致病菌，这些细菌仪引起的疾病范围从表皮感染到爆发性坏血症。铜绿假单胞菌是医院感染的主要原因。它是

45、医院呼吸道感染的首要原因，对于加护病房插管治疗的病人危害极大，死亡率达40%-50%。（ASM，临床微生物手册，第520页）几年前，铜绿假铜绿假单胞菌单胞菌被认为是小儿及成人艾滋病患者发病和死亡的重要原因。2022-2-6107微生物质量相关的产品召回微生物质量相关的产品召回洋葱伯克氏菌及铜绿假单胞菌洋葱伯克氏菌及铜绿假单胞菌产品及污染羟甲唑啉鼻剂-洋葱伯克氏菌氯苯甲烷铵拭巾-洋葱伯克氏菌眼用生理盐水-洋葱伯克氏菌抗菌吸收皂-铜绿假单胞菌2022-2-6108微生物质量相关的产品召回微生物质量相关的产品召回霉菌及霉菌及/或酵母或酵母产品及污染十六烷砒啶漱口液-霉菌及酵母速尿灵-产品中霉菌生长甲

46、地孕酮口服混悬剂-霉菌及酵母对乙酰氨基酚-霉菌阿莫西林-霉菌桉树油-霉菌及酵母羟丙甲基纤维素滴眼剂-青霉素2022-2-6109USP微生物质量接受标准微生物质量接受标准uUSP个论要求是最低的公共标准u通则提供了符合个论要求的方法u有效期内测试u不等于成品所需的所有放行测试无菌测试无菌测试2022-2-6个论中对无菌的通常要求个论中对无菌的通常要求在注射剂中经常会发现下述要求：“当按待检产品无菌测试要求进行膜过滤法测试时符合要求。”在各论中另一种指出无菌测试要求的方法是什么呢？2022-2-6112各论中无菌的通常要求各论中无菌的通常要求吗啡硫酸盐注射剂：“其他要求符合注射剂项下要求。”Fr

47、omInjections注射剂：无菌测试-注射剂应符合 无菌测试的要求2022-2-6113什么是什么是“无菌无菌” ？美国传统的对无菌的观点：“没有细菌或其它微生物”灭菌和无菌保证 中的观点“按照无菌最严格的定义，只有当样品中完全没有活的微生物时，它才能被称为是无菌的”证明产品中完全没有活的微生物，有可能吗？2022-2-6114无菌测试的首要难点无菌测试的首要难点n不能，除非你不准备留下产品进行销售，因为你不将整批产品进行逐个破坏检查是无法证明绝对无菌的n尽管批产品中有污染，但通过无菌测试的概率有多大呢？2022-2-6115无菌测试的首要难点无菌测试的首要难点2022-2-6116无菌测

48、试的首要难点无菌测试的首要难点2022-2-6117无菌测试的首要难点无菌测试的首要难点n假设生产无菌注射剂，批量为20，000瓶，该批染菌率为0.1%，即20瓶，从20，000中随机抽取20（n）瓶进行无菌检查，检查合格的机会P为多少？ P=（1-0.1%）20= 98%2022-2-6118首要难点的推论首要难点的推论如果你不能评估批产品中的每个产品，那根据什么判断产品的？无菌是根据概率的原则判断的。从给定批号的所有产品中存在被污染产品的概率得出判断目的是使其可能性与真实性仅有可接受的微小差异。在无菌保证中将详细讨论2022-2-6119无菌测试无菌测试n我们现在不知道不能用无菌测试合格来

49、证明整批产品的无菌性。n那么，一个产品通过无菌测试能证明什么呢？2022-2-6120无菌测试无菌测试n无菌测试本身并不是设计用于保证产品无菌或产品已灭菌。产品的无菌保证是通过灭菌工艺或灭菌工艺的验证来得到的n无菌测试适用于药典要求无菌的药物成分，配剂或制剂。然而，合格结果仅说明在测试条件下受检的样品中未发现微生物污染。2022-2-6121无菌测试流程无菌测试流程1.培养基和细菌抑制/真菌抑制性测试（方法验证）2.去除任何抑制细菌和真菌生长的因素3.确定用于测试的样品数量，每个样品的用量4.培养样品5.检查测试样品是否有生长的迹象6.显微镜检查有疑问的容器是否有生长的迹象7.必要的话再接种培

50、养8.写报告！2022-2-6122无菌测试：培养基测试无菌测试：培养基测试培养基储存2-25无菌，密闭容器储存不超过验证的期限巯乙醇酸盐液体培养基颜色指示要求符合培养基的无菌每种要求的培养基取一部分在特定温度下培养14天，检查是否浑浊？（为什么不止一个温度？）与测试同时进行培养基的无菌检查（这样做有什么风险吗？）2022-2-6123无菌测试：培养基测试无菌测试：培养基测试生长能力测试：细菌培养3天，真菌培养5天检查生长的迹象“生长”看起来是什么样的？2022-2-6124无菌测试：方法适用性测试无菌测试：方法适用性测试n产品特性允许的话，首选膜过滤法解释：u如果生长，有浑浊产生，和对照一致

51、。u如果不是，你需要修改测试条件以去除抗菌活性u如何做呢？2022-2-6125无菌测试：常规方法无菌测试：常规方法测试的样品量是多少？每个容器中需要转移出的样品量，例如：液体（非抗生素）:装量小于1ml/瓶所有内容物；固体：装量300mg5g150mg每种培养基的样品测试的数量，例如：批量大于500瓶2%或20瓶，取少量。当一个容器的内容物足够用于两种培养基时，该测试数量可等分至两种培养基，否则按药典表中取双倍数量2022-2-6126无菌测试：常规方法无菌测试：常规方法测试的样品量是多少？膜过滤法时，可能的话，使用容器中所有样品直接接种法时，两种培养基中使用同样的样品，除非一个容器中的样品

52、不够用于两种培养基2022-2-6127无菌测试：通常的注意点无菌测试：通常的注意点u无菌测试在无菌环境中进行u注意避免污染的同时，注意不要影响测试对微生物的检出u进行测试的工作环境应通过对工作环境取样，进行定期监控并进行适当的控制u无菌测试时包括适当的阴性对照2022-2-6128无菌测试：常规方法无菌测试：常规方法培养条件：u巯乙醇酸盐液体培养基在32.52.5培养不少于14D，TSB在22.52.5培养不少于14D，观察u在14D的培养过程中定期观察培养基u显微镜检查（浑浊的话，除非合理的将结果视为无效）2022-2-6129无菌测试：结果解释无菌测试：结果解释只有一项或多项下列情况发生

53、时，测试才可能被考察为无效测试：u无菌测试区域的微生物环控数据显示有错误发现u发现测试过程有错误u阴性对照发现微生物阳性u测试污染微生物鉴定后，能明确地将微生物生长归因于用于无菌测试使用的物料/技术发生错误无效测试可重新进行测试灭菌和无菌保证灭菌和无菌保证2022-2-6记住一个挑战记住一个挑战一批产品的无菌保证不是通过 无菌测试 合格而得到的而是通过建立恰当的经过验证的灭菌工艺或无菌工艺过程，且严格执行这些工艺过程的要求来得到的(cGMP)2022-2-6132怎样得到无菌保证？怎样得到无菌保证？无菌保证只能通过适当的灭菌工艺和相应的无菌工艺过程来建立，并严格遵循适当的GMP。通则灭菌和无菌

54、保证 提出了这一条。你认为哪些参数应该被良好的控制和记录呢？2022-2-6133验证和证明灭菌工艺的基本原则验证和证明灭菌工艺的基本原则n工艺与控制设备必须能按照要求的参数运作n在有代表性的设备操作范围内重复进行灭菌工艺并引入产品或模拟产品n证明工艺是在方案中预设的限度内完成的n重复显示经过这样的工艺后，微生物存活的可能性在预设的限度内，生物指示剂经常被使用以证明这一点n日常运作中参数的监控，设备、工艺的定期验证2022-2-6134其他要点其他要点概率：“一批产品被称为无菌是根据概率论来定义的，说明该批产品中，即使只有一个产品被污染的可能性也是微乎其微，可以被接受的”2022-2-6135

55、要求的要求的“概率概率”n通常被接受的无菌保证水平是10-6的微生物存活率或更低，即保证经灭菌的物品或产品中有活的微生物的可能性不超过百万分之一。n我们能做到比10-6更好的吗？2022-2-6136灭菌前的微生物载量灭菌前的微生物载量n通过了解物品的热稳定性，了解灭菌前物品中微生物载量的情况，基于检查，经过适当的时间周期，根据已灭菌产品的实际批数，来建立灭菌工艺2022-2-6137D值值n什么是“D值”nD值是将微生物数量减少90%或1个log所需的时间（min）n例如，如果产品起始微生物数量为100，000cfu/g，暴露在灭菌条件下1min后，剩下10，000cfu/g，D值是多少呢？

56、2022-2-6138如何使用如何使用D值值过度杀灭n在与D值测定的同样条件下，暴露于12个D值的时间后就相当于典型的“过度杀灭”n如果灭菌条件下的有效D值为1.7min，物品需暴露多长时间才能达到过度杀灭呢？2022-2-6139确定暴露在灭菌条件下的确定暴露在灭菌条件下的tn大量的灭菌工艺验证使用生物指示剂来确定物品暴露在灭菌条件下的时间，以达到至少为10-6的SAL2022-2-6140什么是生物指示剂？什么是生物指示剂？灭菌生物指示剂“生物指示剂被广义的定义为：对特定灭菌工艺有抗性的特定微生物的制备物，其特性经过确认”2022-2-6141生物指示剂注意点生物指示剂注意点n假设最差情况

57、，选择指示剂；假设微生物的耐受性相当于生物指示剂，同生物指示剂一样的对待n生物指示剂的耐受性必须大于灭菌产品的自然存在的微生物n根据微生物载量确定的灭菌工艺需定期对产品中的微生物数量及对验证条件的耐受性进行评估2022-2-6142使用生物指示剂举例使用生物指示剂举例n你产品常规的微生物载量为100cfu/gn你决定使用 湿热 灭菌n适当的生物指示剂是：121时D值为1.5min，含1010芽孢n如果产品存在时的微生物杀灭率与生物指示剂D值确定时的杀灭率相同，那么要求杀灭微生物至SAL10-6所需的杀灭时间是多少？2022-2-6143使用生物指示剂举例使用生物指示剂举例你期望生物指示剂中存活

58、的微生物是多少？记住所使用的生物指示剂是含有1010芽孢在暴露于无菌环境后，生物指示剂还含有100cfu以上的微生物，怎么办？2022-2-6144使用生物指示剂举例使用生物指示剂举例考虑调查下列内容：u监测验证过的灭菌工艺的记录u辅助设备、容器/盖子、无菌物品等的灭菌记录u环控数据u变更产品成分的来源，并/成可能造成影响的中控程序2022-2-6145湿热灭菌与湿热灭菌生物指示剂湿热灭菌与湿热灭菌生物指示剂湿热灭菌（蒸汽灭菌）压力下饱和蒸汽的热力学灭菌工艺，可能是应用最广泛的灭菌工艺常用适当的杆菌菌株的芽孢其他耐热芽孢微生物，如生孢梭菌、枯草杆菌、凝结芽孢杆菌也被使用2022-2-6146干

59、热灭菌与干热灭菌生物指示剂干热灭菌与干热灭菌生物指示剂不如湿热灭菌有效产品的干热灭菌通常根据批生产工艺在专门设计的烘箱中进行当设备操作温度不小于250时，典型的空载温度接受范围是15枯草杆菌菌属的芽孢有时也被使用在建立干热灭菌工艺过程中，经常用内毒素去热源研究替代生物灭活研究，因为内毒素的灭活速率比枯草杆菌芽孢的灭菌速率更慢2022-2-6147气体气体灭菌及生物指示剂灭菌及生物指示剂当物料无法承受湿热灭菌或干热灭菌的高温时，经常使用气体灭菌常用气体：环氧乙烷u当所有物料都能接触到气体时是有效的常用于包装材料灭菌，不能用于液体参数严格控制t、RH、P、CETOu灭菌后足够的排空时间，避免影响微

60、生物测定及人员健康u常用萎缩芽孢杆菌的芽孢2022-2-6148VPHP的生物指示剂的生物指示剂使用的微生物包括枯草芽孢杆菌、嗜热脂肪土芽孢杆菌和生孢梭菌的芽孢在实验室作为灭菌剂广泛使用（隔离器内部去污染）2022-2-6149电离辐射灭菌及生物指示剂电离辐射灭菌及生物指示剂“快速增加的医疗器械不耐高温灭菌，而环氧乙烷的安全性问题也使得辐射灭菌的应用增加”两种电离辐射方式：放射性间同位素衰减（r辐射）和电子束辐射u用于原料及成品灭菌u低化学活性，低可检测残留，需控制的参数较少u放射剂量测定经常用于替代生物指示剂u短小芽孢杆菌的芽孢实际的微生物有更强的辐射抵抗力2022-2-6150其它除菌方法