共聚焦原理及操作

1、、细胞内游离Ca2+Ca2+浓度(Ca2+i)(Ca2+i)的测定按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针 Fura-2/AM 或 Fluo-3/AM 来检测细胞内Ca2+i。Fura-2 的结构类似于四竣酸的 Ca2+螯合剂 EGTA,能以 1:1 的比例特异性地与 Ca2+结合，与 EGTA 不同白是 Fura-2 可发出荧光，并且结合 Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2 及其与 Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为 380nm 和 340nm,这种变化可指示 Ca2+的存在及其浓度。Fura-2 为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为

2、Fura-2/AM。后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为 Fura-2,与胞浆中的游离 Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340nm)激发产生荧光。并且，Fura-2 与 Ca2+解离容易，随着游离 Ca2+的增加或减少， 其荧光强度便随之变化。 因此， Fura-2 的荧光强度与Ca2+i 呈比例关系， 据此可以测定Ca2+i及其变化(Malgaroli,A.,etal.,1987)。Fluo-3/AM 是继 Fura-2/AM 等之后研制的新一代 Ca2+荧光指示剂，与 Fura-2/AM 类似，Fluo-3/AM 进入细

3、胞后，酯基被水解掉，Fluo-3 与细胞内游离 Ca2+结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离 Ca2+的浓度。但优于 Fura-2/AM 的是，Fluo-3 与 Ca2+结合时的荧光强度较未结合Ca2+的游离形式高 40100 倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映Ca2+i 的变化。此外，Fluo-3 与 Ca2+亲和力低，易解离，适合测定细胞内 Ca2+的快速、微量变化。Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为 488nm,可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers,R.,etal.,1996)。Ca2+荧光探针用于检测Ca2+i的基本原理如图 7.1

4、 所示。图 Ca2+荧光探针检测Ca2+i 的基本原理a,代表一个细胞模型；b,Ca2+荧光探针的负载；c,Ca2+荧光探针去酯化；d,去酯化的 Ca2+荧光探针与细胞质内游离 Ca2+结合。Fig.ThemechanismforCa2+idetectionbyfluorescentCa2+probe.Ca2+i 的检测方法根据文献(Pan,Z.,etal.,2000),并作适当的改进。具体过程如下：1Ca2+荧光探针负载1 .以无菌 D-Hanks 液清洗各处理细胞三次，加入适量的 Fura-2/AM 或 Fluo-3/AM(终浓度为4M）和 Pluronic-F127（终浓度为 0.05%

5、）,避光，37c 恒温轻轻振荡，孵育 45min。2 .负载后的细胞以含 0.2%牛血清白蛋白的 Hanks 液清洗两次，Hanks 液清洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。3 .按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置 20min,按实验设计作相应检测。2 Ca2+荧光强度的测定2.1 荧光双波长分光光度计测定Ca2+i1 .Fura-2 的荧光强度测定用日立 F-3000 型荧光双波长分光光度计进行。测定条件为：激发光光栅 5nm,发射光光栅 10nm,测定温度为（371）C。2 .取一定量（1X106 个细胞）负载 Fura-2/AM 的细胞悬液，加入到测量用荧

6、光杯中，在上述测定条件下，以激发光波长 300450nm,发射光波长 500nm 进行扫描，检查荧光峰值达最高时的激发波长，判断细胞负载情况，以峰值在 340nm 左右处为最佳负载状态。3 .将测定方式转换为改变波长的时间扫描（波长变换间隔为 2 秒），按以上参数执行双波长测定。4 .测定最大荧光比值（Rmax）和最小荧光比值（Rmin）：加破膜剂 TritonX-100（终浓度为 0.1%）,使 Fura-2 和 Ca2+结合达饱和时，测得的 F340/F380 为 Rmax;加入高浓度的 Ca2+螯合剂 EGTA（终浓度为5mM,pH8.5）,以充分螯合 Ca2+,使 Fura-2 游离，

7、测得的 F340/F380 为 Rmin。5 .2 激光共聚焦显微镜测定Ca2+i.对于 1 组实验中的细胞，直接取细胞皿置激光共聚焦显微镜的载物台上，以 488nm 的僦激光激发Fluo-3 产生绿色荧光，观察各皿中细胞的形态、细胞中 Ca2+的荧光强度及分布变化，拍照。.对于其他组的细胞样品，置激光共聚焦显微镜的载物台上，连续动态扫描选定细胞内Ca2+荧光强度的变化。激发波长为 488nm,发射波长为 515nm,采样频率为 488Hz,每隔sec 扫描一次。细胞内 Ca2+荧光强度变化图像由随机软件进行分析处理，得到细胞内 Ca2+变化（相对荧光强度值）的时间效应曲线，再转换为时间Ca2

8、+i 曲线。激光扫描参数在整个实验过程中不变。为保证实验结果具有良好的重现性，每实验组先后重复 3 次，结果重复性良好。3Ca2+i 的计算根据 Grynkiewicz,G.等（1985）提出的经典公式计算细胞内游离 Ca2+（Ca2+i）的浓度。Fura-2/AM 检测的Ca2+i 计算公式为：Ca2+i=Kd（R-Rmin）/（Rmax-R）（Fmin/Fmax）其中，Kd 为 Fura-2 与 Ca2+反应的解离常数，为 224nM;R 为各测定点 F340/F380 荧光强度比值；Rmax、Rmin 分别为上述测定的最大和最小荧光比值；Fmin、Fmax 分别代表 Ca2+为零及饱和时

9、，在 380nm 激发光下测得的 Fura-2 荧光强度（F380）。实际计算由日立 F-3000 钙测定系统钙定量软件自动求出。Fluo-3/AM 检测的Ca2+i 计算公式为：Ca2+i=Kd（F-Fmin）/（Fmax-F）其中，Kd 为 Fluo-3 的解离常数，为 400nM;F 为对样品检测得到的荧光强度值，Fmax、Fmin 分别为加 0.1%TritonX-100 及 5mMEGTA 时测得的荧光强度值。投票 2 收藏 9单个细胞也是一样的原理：细胞内 Ca2+浓度测定需要的几个基本配套仪器：倒置荧光显微镜一台，CCD（信息采集系统，照相功能），POLYCHROME,MONOC

10、HROMATOR,加药系统一套，TILLVISION 处理软件一套，细胞内 Ca2+结合荧光染料（我们也用 FURO-2）计算机一套暗室当单个或培养的是少数细胞时操作如下：.先将母液 FURO-2 配好（1MG/ML 用荧光专用的 DMSO 溶解置-20 度冻存备用）.观察正常细胞形态.打开所有仪器预热.配孵育液（取 1UL 力口至 ijHANKSBUFFER1ML 中使其终浓度为 1UMOL/ML）.细胞清洗干净，然后将其放于孵育液中约半小时（可试情况加热 37 度）.清洗细胞后换上新的孵育液以备加药用，此时置于浴槽中.将显微镜的油镜滴上油.将浴槽放于显微镜上.先肉眼观察细胞细胞，将所要监测

11、的细胞置于视野最中央.将显微镜打到 SP 状态，镜头打到油镜.打开软件，点击照相即可以观察到细胞其他的关于 PROTOCOL 的设置和数据处理就不用我罗嗦了吧整个实验的注意事项：.所有的只要涉及到有 FURO-2 的步骤都要避光，从配液到孵育和整个的实验过程都要避光孵育时可以在外面罩上锡泊纸实验时要关掉所有光源.荧光 DMSO 有毒性配置时要带手套.肉眼看细胞时显微镜置于眼睛状态采集数据时打到 SP 状态光路才通这个没有什么难的，首先.激光共聚焦镜样本制备常温下取所测细胞悬液于一次性塑料试管中。将细胞悬液进行离心，1000r/min,每次 10min。反复清洗 3 次，吸出上清液后吹打混匀。取

12、 50 膜的细胞悬液，加入 17“的 Fluo-2 钙探针，放入 36.5C 的水浴箱中温育 40min。取温育液 1 小，滴片后拉片，迅速上机观察。.细胞内游离 Ca 离子浓度测定将负载有 Fluo-2 的细胞滴加在载玻片上后拉片，置激光共聚焦显微镜载物台上在荧光镜下观察细胞形态及负载情况，僦激光预扫描，设置扫描条件为激发波长 480nm,发射波长530nm；扫描密度：1024X1024;Pinhole1.00,物镜放大倍数 40X。调节信噪比及焦聚在最佳状态时，以点扫描方式(2X6)扫描，将图像存盘，分析时重新读取。分析软件我们用的是TCS-SP2 型，根据荧光强度与钙离子浓度成正比，所以

13、用平均荧光强度代表游离钙离子浓度。要点：按此 protocol 操作基本上没有什么问题，一些参数可以根据实际仪器和情况作调整。Fura2/AM,测 Ca 离子浓度一.试剂配制：1dc55-Numbered_9dd0b950-ad2d-4b9d-afd7-9feb0ae8fc2Hanksbuffer500ml:NACL4.00gKCL0.20gCACL20.07gMgSO40.10gNA2HPO40.03gKH2PO40.03gGLUOSE0.5gPHENOLRED0.01g,力口 500ml 超纯水，hepes1.19g,调 PH 值 7.4,过滤，4 度冰箱保存。10mMHepes(PH7.

14、4)1dc55-Numbered_9dd0b950-ad2d-4b9d-afd7-9feb0ae8fc2EGTA（乙二醇二乙醛二胺四乙酸）标准滴定溶液（浓度=0.1mol/L）配制称取 3.8g 乙二醇二乙醛二胺四乙酸（分子量=380）,置于 200mL 烧杯中，力口约 50mL 水，低温加热，在不断搅拌下，滴加氢氧化钠溶液（至试剂溶解（PH 值 8.2,）,冷却至室温。移入 100mL 容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。水用纯净。1dc55-Numbered_9dd0b950-ad2d-4b9d-afd7-9feb0ae8fc210%的 TritonX-10300ulTritonX-100 加

15、 3mlhanks,混匀，冷藏备用。1dc55-Numbered_9dd0b950-ad2d-4b9d-afd7-9feb0ae8fc2Hanksbuffer+BSA 的制备Hanksbuffer100ml 加 100“BSA（1g/ml）,震荡混匀。1dc55-Numbered_9dd0b950-ad2d-4b9d-afd7-9feb0ae8fc20.25mmol/LFura2/AM 储备液0.5mgFura-2/AMf 粉末溶于 2mlDMSO 中，分装冷藏备用。二.实验原理作为细胞内钙离子浓度测定的主要荧光染料有 5 中 Quin-2,Indo-1,Fura-2,Fluo-3,Rhod-

16、2。它们均是钙离子的螯合剂 EDTA 的衍生物，有较好的量子产额并队钙有较强的特异性亲合力，这些荧光染料本身不能透过细胞膜进入细胞内，将它连接一个乙酰甲酯后宁可将染料导入细胞中，经细胞内的非特异性的酯酶水解该酯键，释放出染料分子。三.实验方法昀 一甀洀戀攀爀攀搀开昀挀挀 戀搀 戀 戀攀昀 愀攀攀挀愀 一甀洀戀攀爀攀搀开愀搀搀 愀攀 愀 戀 昀昀戀攀昀戀 一甀洀戀攀爀攀搀开挀愀攀搀攀 29491701521 攀搀 攀昀 戀戀 愀愀愀挀愀.细胞悬液的制备：将细胞以 1*10 人 6 个种入皿中， 24 小时后加药， 加药 48 小时后用 hanksbuffer 洗两次， trypsin 消化，离心

17、（1000rp,10 分钟），洗 1 次，将细胞悬浮于 1mlHepes 缓冲的 HANKS+BSA 液中，细胞计数后，使终浓度为 1*10A6-10A7/ml,昀 一甀洀戀攀爀攀搀开昀挀挀 戀搀 戀 戀攀昀 愀攀攀挀愀 一甀洀戀攀爀攀搀开愀搀搀 愀攀 愀 戀 昀昀戀攀昀戀 一甀洀戀攀爀攀搀开挀愀攀搀攀 29491711521 攀搀 攀昀 戀戀 愀愀愀挀愀.钙荧光的导入加入 0.25mmol/LFura2/AM20 科 l,使 Fura-2/AM 浓度为 5 科 mmol/L,加入细胞悬液中，37摄氏度培养箱里温育半小时。 离心， 然后用Hepes缓冲的HANKSbuffer,洗涤1次。 使终

18、浓度为2*106/ml,上机检测。昀 一甀洀戀攀爀攀搀开昀挀挀 戀搀 戀 戀攀昀 愀攀攀挀愀 一甀洀戀攀爀攀搀开愀搀搀 愀攀 愀 戀 昀昀戀攀昀戀 一甀洀戀攀爀攀搀开挀愀攀搀攀 29491721521 攀搀 攀昀 戀戀 愀愀愀挀愀.上机检测：Fura-2 的发射波长为 500,激发波长（340/380）,fura-2 与钙结合后的最大激发波长从 380nm漂移到 340。检测 340、380 两个波长处的值。A.样品上机检测，B.加入 10%Tritonx-100 使终浓度是 0.1%,半小时后上机检测最大值，检测 340、380 两个波长处的值。C.加入 EGTA,是终浓度是 5mmol/L,1ml 加半小时后检测最小值.检测 340、380 两个波长处的值。4 细胞内钙浓度分析上述检测到的是其相对值，要获得真正浓度要对紫蓝光分析钙离子i=kd(FD/FS)*(R-Rmin/Rmax-R),R 是实验观察到的荧光比值(F340/F380),KD 是 fur