基于流式细胞仪分析超声造影剂包膜特性-DOC格式底稿

1、中国科技论文在线基于流式细胞仪分析超声造影剂包膜特性的实验研究#屠娟，陈伟中*（南京大学物理学院声科学与工程系，近代声学（教育部）重点实验室，南京 210093）摘要：本文采用进过改进的流式细胞仪测量了单个 Definity超声造影剂微泡的动力学行为，并对其包膜特性（剪切模量及剪切粘度）进行了分析。通过对实验测量得到的微泡动力学响应数据进行气泡动力学拟合来可以确定不同驱动声压下造影剂微泡的包膜特性。结果显示：造影剂微泡包膜的剪切粘度随微泡平衡半径的增大而增大，随剪切速率的增大而减小；而包膜的弹性系数不随微泡的大小而变化。关键词：超声造影剂；流式细胞仪；气泡动力学；包膜特性中图分类号：O424M

2、icrobubble Shell Characterization Using Flow CytometryTU Juan, CHEN Weizhong(Dept. of Acoustics, School of Physics, Key Laboratory of Modern Acoustics (Ministry ofEducation), Nanjing University, Nanjing 210093, China)Abstract: Experiments were performed to evaluate the shell parameters for individua

3、lDefinityultrasound contrast microbubbles using a modified flow cytometer. The shell parameters(shear modulus and shear viscosity) were quantified at different acoustic pressures by fittingmicrobubble response data to a bubble dynamics model. The results show that: (1) the shell shearviscosity incre

4、ases with increasing equilibrium microbubble size, and decreases with increasing shearrate; (2)the shell elasticity does not vary with microbubble size.Key words: Ultrasound Contrast Agents; Flow Cytometery; Bubble Dynamics; Shell Properties0 引言超声造影剂（UCA）是由薄膜层（如：脂类；清蛋白；聚合物等）包裹气体形成的微米量级的包膜气泡。由于气体和血液组

5、织的声阻抗相差较大，造影剂微泡能提高多普勒或1得到广泛关注2-4。数目、大小分布及其包膜特性造影剂微泡的重要参数，对于决定气泡的5,67对 SonoVue®微泡群实施衰减测量并推算-98用声散射的方法估算了 Albunex®和另一种实验用的造影剂。Sboros et. Al.9原子力显微®al.10， Dayton et. al. 11 和 van der Meer et. al.12 应用直接光学成像的方法测得SonoVue®微泡包膜对入射声场的响应，并指出其包膜的粘滞系数随着微泡的平衡半径 R0 的增加而增加。我们之前的工作提出利用实验室 Mie 散

6、射系统也可以通过超声驱动下的微泡动力学行5基金项目：国家自然科学基金项目 （10704037，10974093 和 11074123）和教育部博士点（新教师）基金(20070284070)作者简介：屠娟（1976）， 女，副教授，主要研究方向：非线性声学，医学超声，声空化. E-mail:juantu-1-B-mode 图像的对比度 。最近，与超声生化效应相关的造影剂在治疗领域的潜在应用也日益许多功能特性是非常重要的。Gorce et. al.出包膜平均弹性系数÷ = 0.55 N/m 且其包膜粘滞系数ês=7.2×10kg/s。Chang et. al.镜分析了

7、 biSphere 微泡膜的特性并估算出微泡在静态时的弹性系数为 1 6 N/m。Morgan et.为的测量来获取其包膜的特征信息 。尤其是通过动力学模型拟合实验数据我们发现包膜的中国科技论文在线6等提出这种弹性系数和粘滞系数变化随微泡大小的变化趋势是一个假象，因为之前研究中所13在本文中，我们通过改进现有的商用流式细胞仪，构造了一套动态 Mie 散射系统来测量微气泡的动力学行为及其包膜特性。本文的工作主要包括以下几个部分：实验系统部分，介绍了超声驱动下基于流式细胞仪的 Mie 散射测量系统；包膜微泡动力学模型部分，我们采用了能够很好描述脂类体包膜微泡的非线性理论模型；结果部分，我们测量了在

8、 1MHz 超声驱动下造影剂微泡的动力学响应曲线，并通过对实验结果进行气泡动力学模型拟合，得到如下结论：（1）Definity®包膜的粘滞系数随着气泡环境半径的增大而增大；（2）随着剪切速率的增大而减小，意味着包膜是剪切变薄的；（3）微泡的包膜弹性系数参量与其初始半径无关。1 实验材料与方法1.1实验材料本文中我们使用的造影剂主要是 Definity®（Lantheus Medical Imaging, NorthBillerica, MA，USA），这也是现今人们广泛使用的新一代的造影剂。据厂家说明，Definity®是由一层极薄的脂类膜包裹八氟丙烷（Octaf

9、luoropropane）气体构成的微泡造影剂，平均10个/毫升。1.2实验设备如图 1 所示，我们用一个 150 µm 流通槽连接细胞仪 InFlux Cell Sorter （BDBiosciences, San Jose, CA），并用一个石英（Hamamatsu Photonics, Japan）流通池作为测量室来取代标准的流式细胞仪喷嘴，再将一块中心工作频率为 1MHz 的压电换能器贴于流通池的一侧来提供微泡的驱动声场，由函数信号发生器 (Agilent 33250A, CA, USA) 经过射频放大器（A150, ENI, Rochester, NY） 连接射频衰减器（8

10、37 Attenuator, KayElemetrics Corp, Lincoln Park, NJ）来提供声源驱动信号。图 1 实验系统框图在光学系统中，采用标准侧散射（90 ）来采集散射光信号，光源是 500 mW、488 nm 的激光（Sapphire 488-500, Coherent Inc., Santa Clara, CA），通过 75mm 的镜头聚焦成直径为 65µm 的点。通过光电倍增管 PMT (Hamamatsu, model 2027) 获取的信号被送到高带-2-粘滞系数的变化趋势和直接应用光学成像方法所得的结果是一样的 。遗憾的是， Doinikov使用的

11、线性简化方程并不能完全精确地描述包膜气泡动力学行为。直径为2 µm，微泡浓度为10中国科技论文在线宽（6 dB at 5 MHz）的电流电压转化器和前置对数放大器中，与 Shapiro14所述类似。以流式细胞仪（InFlux cytometer）提供的 Spigot 软件包用来控制侧散射 PMT 的增益设置。用 PXI 数据采集和存储系统将信号进行数字化处理和存储，用 25MHz 采样频率对微泡动力学响应进行数据采集并保存至电脑。1.3数据校准根据 Mie 散射理论可以将 PMT 的电压输出数据转换为微泡的半径信息。Mie 散射理论对包膜球体的修正首先由 Aden 和 Kerker1

12、5 16,17泡的测量中。本实验中研究微泡所采用的光散射模型基于 Bohren 和 Huffman18书中所描述的方程。一般来说，为了计算微泡散射的相对光强，我们需要算出包膜内气体和包膜各自的散射系数16,17，但是由于包膜的厚度极薄（小于 15nm），包膜气泡的光散射特性基本与自由空518-20总的来说，散射光强是与气泡半径大小和散射角度相关的复杂函数。在我们的系统中，PMT 分别置于前端散射和侧边散射的位置。在校准中，我们只用到和入射激光成 90 的侧边散射 PMT，由物镜的数值孔径来决定实际的散射光接收角度范围（NA=0.42= n sin è1/2 ），然后对所有角度进行积分

13、处理。在动力学测量前，用半径为 0.25µm, 0.5µm, 1µm, 2.9µm, 和5 µm 玻璃微球（YG beads）（Invitrogen, Carlsbad, CA）来校准散射光的强度，再用 MATLAB软件算出散射系数。在图 2 中，实心点表示用玻璃球校准测得的相对光强，我们根据实线所示的理论计算值来拟合实验数据，并由此确定 Mie 散射系数。如当玻璃粉和水的折射率分别为 nw=1.33,nb=1.59 时，把微泡的折射率定为 nuca=1，我们可以根据理论计算得到微泡半径与相对光强之间的关系，如图 2 中虚线所示。不难发现，微泡

14、的散射光强随着气泡半径增大呈现单调递增趋势，这为我们提供了微泡半径和光强一一对应的关系。图 2 散射光强与微泡大小的对应关系校准曲线2 非线性包膜气泡动力学模型为了得到微泡包膜的具体信息，我们应用流式细胞实验所得的气泡半径响应的数据来与气泡动力学方程相拟合。随着气泡动力学的发展，目前有很多考虑包膜特性如厚度、粘滞系数、弹性系数、摩擦系数、表面张力13, 21-26等来描述包膜气泡动态响应的模型。为了保持与-3-提出并后来被 Marston 等人应用到对包膜气气泡相同 ，因此在计算中造影剂微泡的包膜散射特性基本可以被忽略掉。由于气泡散射系数的数学推导过于繁琐，本文不做过多的描述，有兴趣的读者可以

15、参考文献。中国科技论文在线我们之前研究 Definity®微泡工作的连贯性，我们采用 Marmottant 等人26所提出的非线性包膜气泡动力学模型，这种模型可以适用于描述更大振幅超声驱动下的的脂类包膜气泡的动力学行为。在 Marmottant 等人的文章中指出对于磷脂类包膜微泡，可测的每一个磷脂分子的表面积随微泡的振动会发生改变。模型设定，Rbuckling 为使微泡变形的半径值，Rbreak-up 为使微泡破裂的半径值，当 R<Rbuckling 时，微泡由于皱缩而不随超声驱动发生形变；当 R>Rbreak-up时，微泡破裂。这表明，包膜的弹性系数可以由与其半径相关的

16、表面张力系数来决定，并建立相应模型。Marmottant 的模型的动态方程为以下形式：ñ l (RR +3 22( ) (1 R) P + Pa (t ) , (1)R0 R0 c R R R 2为了简洁，本文中我们把方程（1）都简称为 Marmottant 模型，其中，R 和 R0 分别微泡的瞬时半径和环境半径， R 和 R 表示 R 对时间的一次和二次导数。ñl 和 çl 分别为牛顿流体的密度和粘滞系数；P0 是环境压强；ã 气体的多变指数；c 液体中的声速；ês 包膜的膨胀粘滞系数；Pa(t) 是正弦驱动声压。包膜的表面张力ó(

17、R) 可以描述为： 0,2 Rbuckling water rupture(2)其中÷是包膜弹性压缩模量。对于大振幅驱动时，表面张力起初在弹性范围内，直到 R 达到临界值 R=Rbreak-up 为止；尽管由于包膜的粘滞力的影响，初始的óbreak-up 会比ówater 要大一些，但是一旦微泡破裂后，其表面张力的值将会恢复到没有包膜的自由气泡的表面张力值ówater，并在 R>Rrupture 时保持不变；当 Rbuckling<R<Rrupture 时，表面张力可逆得回到弹性脉动范围； Rrupture.定义为恰好每一次包膜破裂时气

18、泡所达到的半径，此时ó ( R) = ó water 。3 结果与讨论3.1Definity®微泡的平衡半径测量实验开始时我们关闭驱动声场，把充分稀释的 Definity®悬浮液注射到我们的实验系统中，当单个微泡进入激光束区域时，PMT 输出的电压值会增大，当这个微泡流出时，电压值减弱。关于 Definity®微泡的典型的电压随时间变化的曲线如图 3 所示。电压的峰值与微泡的半径大小相关，同时其脉冲宽度取决于微泡经过激光束所需的时间。为了得到平衡半径R0，我们把测得的信号通过低通滤器，所得结果如图 3 虚线所示。然后我们可以按图 2 的曲线来校

19、准现有的结果并提取出 R0。-4-R ) = P0 +2ó ( R0 ) R 3ã 3ã 2ó ( R) 4çl R 4ê s R0if R Rbuckling R0 R ó = 0.072 N / m, if R > R中国科技论文在线图 3 微泡平衡半径的测量3.2Definity®微泡包膜的特性描述当驱动超声开启时，图 3 中的曲线将会变成图 4a 的情况。如图 4a 所示，如果微泡通过激光散射区域并同时受到声场的作用，将会有一个动态高频振动信号叠加加在低频散射散射信号之上（见图 4b 中虚线区域内的波

20、型信号），且较大的波振幅意味着较强烈的微泡振动。根据图 2 所示的 UCA 校准曲线，我们可以把测得的相对光强转换为微泡半径随超声驱动的响应曲线 R(t)（如图 4b 所示）。接着我们可以通过低通滤波提取出 R0，也可以通过高通滤波来生成半径-时间曲线，然后采用 Marmottant 模型对其进行拟合并进一步分析微泡包膜特性。Marmottant 模型中涉及的气泡参数包括平衡半径、驱动声压、驱动频率、包膜粘滞系数和包膜弹性系数，平衡半径已由上面的方法得出，驱动频率是 1MHz。驱动声压的幅值可以由水听器校准方式来测得。实验中我们采用的驱动 Definity® 微泡的超声信号频率为 1

21、- MHz 、声压范围为 95kPa<Pa< 333 kPa。 Marmottant 的模型的参数（÷，ês）将根据数据拟合的最小标准偏差（STD）来进行优化，相应的 STD 定义如下：STD =tendi =tstartexp,iN Rcal ,i )2,(3)其中 tstart 和 tstart 分别表示拟合区段的起始点和结束点，Rexp,i 和 Rcal,i 分别表示随时间顺序的第 i 个实验测得的微泡半径和模拟出来的微泡半径，N 是拟合点数。下面这些是模拟所需的一些物理常量： P0 = 1.013×105 Pa， Pv = 2.33 kPa，

22、ñg= 1.161 kg/m3， ã=1.07， ñl =103 kg/m；c = 1500 m/s；l = 2×10-3 Pa·s 12。-5- ( R中国科技论文在线图 4 超声驱动下的微泡半径随时间演化情况 （a）通过流式细胞仪测得的 1-MHz 超声驱动下的微泡散射光强随时间演化曲线；（b）根据校准曲线转换而来的 1-MHz 超声驱动下的微泡 R(t)曲线。图 5 是 R(t)拟合的一个示例，我们在图例中标出了相应的最佳拟合参数。如图所示，Definity® 微泡的 R(t) 曲线和 Marmottant 模型拟合得很好。Go

23、rce et. al.7 对直径分布约为0.7 to 10 µm 的脂类 SonoVue®微泡进行衰减测定并推出平均包膜弹性系数÷ = 0.55 N/m，粘滞系数ês = 7.2 ×10-9 kg/s。通过分析微泡的光谱信息来拟合 R(t)曲线，van der Meer et. al. 12指出对于脂类 BR14 微泡，最佳拟合参数为÷ = 0.54±0.10 N/m，而ês 的值在 10-9 10-8 kg/s 范围之内。在图 5 所示的这个特定的例子中，最佳拟合参数÷ = 0.5 N/m 和 

24、4;s = 2.8 ×10-9 kg/s，与之前报道的结果一致。这也表明流式细胞仪可以用来检测微泡包膜的性质。图 5 基于 Marmottant 模型对实验测得微泡 R(t)曲线进行最优化拟合3.3包膜参数与初始微泡半径的关系我们已经知道可以用流式细胞仪来记录微泡的响应曲线并将其与 Marmottant 的模型拟合得出 Definity®微泡包膜的参数值。我们把这种思路应用于研究 Definity®微泡的包膜参数(÷ 和 ês) 和 微泡平衡半径 R0 之间的关系中。在这组实验中，我们采用频率为 1MHz、声压范围为 95 kPa 333 kP

25、a 的正弦驱动超声脉冲。在每一个声压级，我们收集 40 个微泡的数据。-6-中国科技论文在线图 6 微泡包膜弹性模量与其平衡半径之间的关系如图 6 所示，在实验误差范围之内，微泡脂类包膜的弹性模量÷为常数，其值约为0.70N/m。据报导，采用 Doinikov 简化模型13或线性的 Marmottant 的模型6来拟合脂类微泡动力学响应时，其包膜弹性模量÷会随 R0 而变化。然而当我们采取完整的 Marmottant 非线性模型时，我们发现弹性模量接近为一个常数。这种差别可能源自气泡动力学模型的选取。由于脂类包膜复杂的流变变化，当受到越强的超声脉冲波激发时，微泡产生的非线性

26、响应也就更加强烈，从而导致了不同的包膜特性评估。在我们之前的 SonoVue®微泡研究6中，我们采用了线性的 Marmottant 的模型，我们发现这并不是严格有效的，因为该线性模型应该仅仅适用于驱动声压较小的情况。而在 Doinikov 等人的研究中所使用的动力学模型，是在假设包膜厚度为 0 的前提下，将 Church 方程简化而来。他们得出包膜的弹性系数随着 R0 的增大而增大，但同时他们也在讨论中指出包膜弹性系数依赖于 R0 的现象可能是一个假象，因为作为一种物质的基本物理常量，÷应该是独立于整个膜材料和它的表面积的。他们在文章中特别指出简化的模型可能不能够解释脂类包

27、膜复杂的流变特性，这样就导致了微泡包膜的弹性系数与微泡大小相关的假象。由于采用了更强的非线性模型，我们目前的结果表明对于不同大小的脂类微泡，其包膜有相对一致的弹性模量。图 7 微泡包膜粘滞系数与其平衡半径之间的关系而对于包膜粘滞系数的研究显示（如图 7 所示），Definity®包膜的粘滞系数ês 随着 R0 的增大而增大，这与我们之前观察的 SonoVue®脂类微泡得到的结果6, 10-13是一致的。Van derMeer et. al.12猜测粘滞系数随 R0 而变化应该是由“剪切变薄”现象引起的，因为与包膜粘-7-中国科技论文在线滞系数变化应该正比于其膨胀剪

28、切率RR。在图 8 中绘出了 Definity®微泡包膜的粘滞系数与其最大剪切速率RR之间的关系。如图所示，Definity®的最大的剪切速率随着驱动声压增大而增大，这与大声压可以诱导大振幅振荡原理是一致的。更重要的是，包膜的粘滞系数随着剪切速率的增加而减小，这符合“剪切变薄”的假设。图 8 微泡包膜粘滞系数与最大剪切速率之间的关系4 结论我们在现有的商用流式细胞仪上加置超声换能器来“激活”经过细胞仪测量区的微泡。通过记录每一个 Definity®微泡的半径时间演化曲线 R(t)，并用 Marmottant 非线性模型对其进行拟合，我们可以对 Definity&#

29、174;微泡包膜的参数特性进行分析。结果显示：Definity®微泡包膜的粘滞系数ês 随其初始半径 R0 的增大而增大，随其膨胀剪切率的增大而减小，而包膜的弹性模量÷基本保持常数。综上所述，实验证明用流式细胞仪测量超声造影剂的包膜特性具有实时、快捷、精确和高效的优点。同时流式细胞仪还可以测量微泡数量及其大小分布情况，因此这种方法为我们提供了一个实用的研究造影剂微泡物理性质的一体化系统。致谢本工作受到如下基金的支持：国家自然科学基金项目 （ 10704037， 10974093 和11074123）和教育部博士点（新教师）基金 (20070284070)。参考文献

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