非霍奇金淋巴瘤造血干细胞移植病人的微量肿瘤细胞检测.

1、非霍奇金淋巴瘤造血干细胞移植病人的微量肿瘤细胞检测关键词： 淋巴瘤，非霍奇金氏；造血干细胞；肿瘤循环细胞/ 诊断中分类号：R733；R457文献标识码：A文章编号：1000-7431(2000)04-0304-03大剂量放、化疗后进行自体骨髓移植 (ABMT)或外周血干细胞移植 (PBSCT)治疗高危或复发非霍奇金淋巴瘤 (NHL)已取得良好疗效，但复发仍是治疗失败的主要原因。越来越多的证据表明，体内残留或回输的肿瘤细胞可导致复发，缩短病人的生存期 1 4 。因此，检测体内和移植物中残留的微量肿瘤细胞具有重要的临床意义。常规的形态学检查仅在肿瘤细胞达到 5 %以上时才能得到阳性结果 5。近年发

2、展的 PCR等分子生物学技术通过测定基因重排能在 105 106 个正常细胞中检测到 1 个肿瘤细胞 2 4 ，从而使微量肿瘤细胞的检测成为可能。本文就 NHL常见的基因标志、检测方法及临床意义作一综述，重点讨论微量肿瘤细胞检测在 NHL病人自体造血干细胞移植中的应用。一、 NHL的基因标志1. 肿瘤细胞特异性基因标志由于染色体易位形成的基因重排，为肿瘤细胞所特有，可作为肿瘤特异性基因标志。如 NHL中，常见由 t(14 ； 18) 形成的 bcl-2/IgH 、t(11 ；14) 形成的 bcl-1/PRAD-1 及 t(8;14) 形成的 myc/IgH 基因重排，分别见于滤泡型及少数弥漫

3、性大细胞型淋巴瘤，外套细胞型淋巴瘤，小无核裂细胞型及 Burkitt's 淋巴瘤，但大部分 NHL并无这类基因标志，因此其临床应用范围有限。2. 肿瘤细胞克隆特异性基因标志淋巴细胞在分化成熟的过程中要进行免疫球蛋白重链(IgH) 或 T 细胞抗原受体 (TCR)基因重排，重排的 DNA序列具有较高的多态性及细胞克隆特异性，正常及反应性淋巴细胞为多克隆性基因重排，淋巴瘤为单克隆性 ( 偶有寡克隆 ) 基因重排，据此可区分正常细胞与肿瘤细胞。由于 IgH 和 TCR克隆性基因重排几乎见于所有淋巴系统恶性肿瘤，故具有重要的应用价值。二、微量肿瘤细胞的检测方法1. 非分子生物学的方法采用形态学

4、检查或分裂中期细胞染色体核型分析，敏感性仅为1 %10 %，难以查知微量肿瘤细胞。免疫表型分析可将敏感性提高到0.1 % 。细胞培养的方法不仅能证实瘤细胞的存在，而且能推测这些细胞是否具有体内增殖、导致复发的能力，敏感性为 1/10 4，但缺点是所得结果难以重复 6 。2. 分子生物学的方法Southern bolt 是最早用于肿瘤基因诊断的分子生物学技术之一。克隆性IgH、 TCR重排及 bcl-2/IgH 等融合基因均可用此法检测，检测的敏感性为1 % 5 %7。此方法有诸多缺点，如：操作复杂、有同位素污染、所需模板DNA量大且完整，故近年来已逐渐被 PCR技术所取代。与 Southern

5、 blot 相比， PCR方法敏感、简便、快速，仅需较少量 DNA做模板，无论新鲜标本，或长期保存的石蜡包埋组织及骨髓、外周血涂片皆可进行检测。检测的敏感性可达到 1/10 5 1/10 6。但以共有引物 PCR方法测定淋巴瘤克隆性 IgH、TCR基因重排时，因正常淋巴细胞产生的多克隆背景干扰，敏感性下降。为了克服这种干扰，提高检出率，可采取下列措施：a. 对来自肿瘤组织的 PCR产物测序，合成克隆特异性的寡核苷酸探针或引物，再用这一探针或引物检测微量肿瘤细胞。此法检测克隆性IgH CDR3重排的敏感性可达 1/10 4 。由于要对每个病人的 PCR产物测序，合成各自的克隆特异性探针或引物，难

6、度大、花费高，故不适合广泛的临床应用3。 b.PCR与 DNA单链构象多态性 (SSCP)分析结合，能在多克隆重排背景下检出单克隆IgH 重排，敏感性为 1/1000 2/1000 ，也可在此基础上快速克隆和测序，合成克隆特异性引物以检测更微量的肿瘤细胞 8。 c.PCR与温度梯度凝胶电泳 (TGGE)结合。传统的琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)仅根据片段大小分辨 DNA， TGGE通过两套独立的冷热水循环系统在电泳槽上制造线性的温度梯度，在给定的温度下双螺旋DNA片段部分解链，产生非配对的碱基，影响其电泳速率。在TGGE时同质双螺旋体较异质双螺旋体泳动快，从而得到一种特异的带型。此法

7、已成功地应用于IgH 及 TCR基因重排的分析。巢式 PCR与 TGGE结合，可在 103105 个正常细胞中检出一个肿瘤细胞 9，10。 d.PCR与变性梯度凝胶电泳 (DGGE)结合。 DGGE在聚丙烯酰胺凝胶中加入尿素做变性剂，当双链 DNA片段泳动至某一凝胶区域，该区域的变性梯度与 DNA片段的低温融解区的融解温度相匹配时， DNA分子解链呈分枝状，在凝胶中泳动减慢，形成一条滞后的带，这样就可分离碱基顺序不同的 DNA片段。在 PAGE分析结果模棱两可时，用 DGGE分析有意义 11 。e. 流式细胞仪或基因扫描仪检测带荧光标记引物的 PCR产物，敏感性为 1/10 5 12， 13

8、。f. 多对引物联合应用可提高检出率 3， 4， 7 。三、 NHL病人骨髓及外周血微量肿瘤细胞检测的临床意义1. 诊断大部分 NHL能通过病理形态学和免疫组织化学确诊，少数病例从形态学上难以确诊，而且一些量少、无组织结构的标本如细针抽取物、脑脊液、胸水、腹水等，仅靠细胞学难以诊断，若发现单克隆IgH 或 TCR基因重排、或肿瘤细胞特异性的融合基因存在，则有利于肿瘤的诊断。某些良性疾病偶尔也可发生单克隆 IgH 或 TCR基因重排，因此基因诊断必须与病理形态及免疫组化结合才能提高诊断的准确性。另外单克隆IgH 或 TCR基因重排还可以明确肿瘤细胞的来源，克隆 IgH 重排主要见于 B 细胞淋巴

9、瘤， TCR重排主要见于 T 细胞肿瘤，但在早期分化阶段的细胞可以见到交叉重排现象。2. 分期由于检测的高敏感性，不少作者报告在形态学检查正常的 NHL病人的骨髓和外周血中以分子生物学技术检出微量肿瘤细胞，提示一部分、期病人单纯局部治疗后可能复发的原因。 Hickish 等 14 将骨髓活检病理、骨髓穿刺及外周血 PCR检查的结果进行了比较，认为 PCR能将 50 %患者的分期下调，但目前尚缺乏大宗病例长期观察、期病人骨髓和外周血 PCR测定结果。3.NHL 治疗的选择Gribben 等用 PCR检测 102 例晚期 NHL病人治疗前骨髓细胞的bcl-2重排， 70 %呈阳性；诱导或挽救治疗后

10、， 50 %患者 BM形态学已呈正常，但 PCR分析仍为阳性，表明传统的治疗不能根除 bcl-2 重排阳性的细胞 15 。在造血干细胞移植方面，是否外周血干细胞移植 (PBSCT)优于骨髓移植，也有不同看法。大部分作者认为： BM比 PB残留肿瘤细胞的阳性率高，加之 PBSCT比 ABMT有造血恢复快等优点，使 PBSCT有取代 ABMT的趋势。但 Robert 在 60 例行 ABMT的NHL患者中，用 PCR检测未净化 BM采集物细胞与几乎同时采集的外周血单个核细胞的 bcl-2 重排，发现两者阳性率相似，皆为 25 %。Jacquy 等研究了 14 例期外套细胞型淋巴瘤，在多个疗程化疗、

11、用 G-CSF动员后采集的外周血干细胞中均检测出 t(11 14) 阳性细胞，说明晚期 NHL，尤其某些病理类型的NHL， BM及 PB均有瘤细胞浸润，而且动员后肿瘤细胞可能进入血循环 4 ，所以需要利用微量肿瘤细胞检测技术进一步比较 BM与动员后所采集的外周血干细胞中瘤细胞的污染情况，以决定是进行 ABMT还是 PBSCT。4. 体外净化效果评价Negrin 等用系列稀释法 PCR及 DNA印迹杂交对免疫净化前后的骨髓及外周血进行检测，净化前 bcl-2 阳性细胞占 1 %5 %，净化后阳性细胞下降 3 4个对数级。 Widmer等用竞争 PCR法测有 bcl-2/IgH的 NHL病人，采集

12、的7 份骨+髓和 2 份外周血干细胞经过CD34 选择后，污染的瘤细胞减少1 4 个对数级，其中 2 份标本 PCR转阴，另 7 份仍含有 10200 个瘤细胞 /10 6 个单个核细胞。后 7 份标本经体外扩增 714 天， 6 例转为 PCR阴性。5. 移植物中及治疗后体内残留的瘤细胞是否具有预测复发、判断预后的意义。Gribben 等 1993 年报告 2 134 例有 bcl-2 易位的 B 细胞淋巴瘤，用 PCR检测净化效果， 121 例采集的 BM在净化前均有瘤细胞，免疫净化后 66 例无残存瘤细胞， 55 例有残存瘤细胞，经移植前者的无病生存率高于后者 (5 年无病生存率为 75

13、 %及 30 %)。患者移植后体内 BM的 PCR结果也与生存期有关。在 ABMT 后完全缓解期收集的 542 份 BM，其中 PCR阴性者 60 %以上无病生存期超过 5 年，阳性者平均无病生存期为 15 个月 (P 0.00001) ，而后者复发的危险性是前者的 48 倍。 58 例 PCR持续阴性及 19 例早期阳性以后转为阴性者无一复发，PCR持续阳性或阴转阳性者大部分病例复发， 33 例复发者复发前 BM中均查到淋巴瘤细胞。有趣的是，净化后移植物中仍残存瘤细胞的 55 例中， 11 例在移植后体内 BM未检出瘤细胞，生存率比另 44 例检出瘤细胞者高。这 11 例移植物中残存的瘤细胞

14、可能因采集前受到过大剂量化疗的损伤或宿主免疫机制的作用而丧失了克隆增殖的能力。近两年 Caroline 、 Neuhoff 等在进行 ABMT及自体PBSCT的 NHL病人中也得到类似结果 3 。但是， Hardingdam 等 1 1995 年报告 24 例预后差的 NHL患者进行自体PBSCT，其输入的干细胞中肿瘤标志物是否阳性与生存率无关。 Price 等观察 15 例持续完全缓解 10 年以上的患者，其中、期患者 7 例， PCR查 bcl-2/IgH均阴性；期、期 8 例， 6 例为 PCR阳性，继续观察一年，所有患者仍为完全缓解期。四、结语应用分子生物学技术检测肿瘤标志物为 NHL

15、的早期诊断、鉴别诊断、病变范围的估计及克隆来源分析提供了一项新的手段。尤其治疗后微量残留细胞的检测，对复发、预后的估计具有重要意义。但应注意任何实验方法都有局限性，如：标本中正常淋巴细胞的存在使 PCR检测的敏感性降低；所用的引物只能扩增 80 %左右的基因重排，不能包括所有病变等。目前的实验技术尚不能精确判断何种水平之上的残留病变对复发具有预测价值，也不清楚 PCR阳性持续多长时间便应给予治疗。虽然大多数研究提示，残留病变可导致复发、降低生存率，但少数有残留病者仍能长期生存。这些问题皆有待进一步研究。( 本文编辑：戴峰)作者简介：李振玲，女，在读硕士，主治医师。作者单位：李振玲（中国医学科学

16、院、中国协和医科大学北京协和医院血液科北京 100730 ）沈悌（中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院血液科北京100730）郦筱能（中国医学科学院、中国协和医科大学北京协和医院血液科北京100730）参考文献1Hardingham JB,Kotasek D,Sage RE,et al.Significance of molecular marker-positive cell after autologous peripheral-bloodstem-cell transplantation for non-Hodgkin's lymphoma J .J Clin Oncol

17、,1995,13(5):10732Gribben JG,Neuberg D,Freedman AS,et al.Detection by polymerase chain reaction of residual cells with the bcl-2 translocation isassociated with increased risk of relapse after autologous bone marrow transplantation for B-cell lymphoma J .Blood,1993,81(12):34493Zwicky CS,Maddocks AB,A

18、ndersen N,et al.Eradication ofpolymerase chain reaction detectable immunoglobulin gene rearrangement in non-Hodgkin's lymphoma is associated with decreased relapse after autologous bone marrow transplantation J .Blood,1996,88(9):33144Corradini P,Astolfi M,Cherasco C,et al.Molecular monitoring of

19、 minimal residual disease in follicular and mantle cell non-Hodgkin's lymphomas treated with high-dose chemotherapy and peripheral bloodprogenitor cell autograftingJ.Blood,1997,89(2):7245Coad JE,Olson DJ,Christensen DR,et al.Correlation of PCR-detected clonal gene rearrangements with bone marrow

20、 morphology inpatients with B-lineage lymphomasJ.Am J SurgPathol,1997,21(9):10476Sharp JG,Joshi SS,Armitage JO,et al.Significance of detection occult non-Hodgkin's lymphoma in histologically uninvolved bonemarrow by a culture technique J .Blood,1992,79(4):1074 7Achille A,Scarpa A,Montresor M,et

21、al.Routine application ofpolymerase chain reaction in the diagnosis of monoclonality of B-celllymphoid proliferations J .Diagn Mol Pathol,1995,4(1):148Davis TH,Yockey CE,Balk SP.Detection of clonal immunoglobulin gene rearrangements by polymerase chain reaction amplification andsingle-strand conform

22、ational polymorphism analysis J.Am J Pathol,1993,142:18419Suttorp M,Neuhoff NV,Tiemann M,et al.Precast commercial polyacrylamide gels for separasion of amplificates by temperature gradient gel electrophoresis:application to clonality analysis of lymphomas J .Electrophoresis,1996,17:672 10Scheller U,

23、Muche JM,Sterry W,et al.Detectin of clonal T cellsin cutaneous T cell lymphoma by polymerase chain reaction:Comparison of mutation detection enhancement-polyacrylamide gel electrophoresis,temperature gradient gel electrophoresis and fragmentanalysis of sequencing gelsJ.Electrophoresis,1998,19:653 11Lozano MD,Tierens A,Greiner TC,et al.Clonality analysis of B-lymphoid proliferations using the polymerase chain reaction J .Cancer,1996,77:1349 12Barker RL,Worth CA,Peiper SC,Cytometric detect