分子病理学方法2014研究生用

1、第十八章第十八章 分子病理学方法分子病理学方法1.探讨疾病发生分子机制的基本思路探讨疾病发生分子机制的基本思路 探讨基因结构的改变与疾病发生的关系探讨基因结构的改变与疾病发生的关系 探讨基因表达的改变与疾病发生的关系探讨基因表达的改变与疾病发生的关系蛋白质水平蛋白质水平核酸水平核酸水平 寻找疾病相关基因寻找疾病相关基因2.分子克隆及分子探针制作技术分子克隆及分子探针制作技术 限制性内切酶限制性内切酶 质粒载体质粒载体 分子克隆的步骤分子克隆的步骤 分子探针的制作分子探针的制作 常用标记物及显示系统常用标记物及显示系统核酸酶 核酸外切酶 核酸内切酶限制性内切酶限制性内切酶 限制性内切酶是核酸酶的

2、一种，核酸酶通常是限制性内切酶是核酸酶的一种，核酸酶通常是指能够水解磷酸二脂键裂解指能够水解磷酸二脂键裂解DNA或或RNA的酶。的酶。 有些核酸酶对有些核酸酶对DNA的裂解是非特异的，也就是的裂解是非特异的，也就是说它们在核酸分子内的切割是随机的。说它们在核酸分子内的切割是随机的。 而另一些酶却能识别而另一些酶却能识别DNA分子的某些特定序列分子的某些特定序列对对DNA分子有选择的切割，这种酶就称为限制分子有选择的切割，这种酶就称为限制性内切核酸酶（限制酶）。性内切核酸酶（限制酶）。回文结构 回文结构：双链DNA中含有的结构相同、方向相反的序列。 例如：5GGTACC3 3CCATGG5限制性

3、内切酶限制性内切酶（Eco R）GAATTCCTTAAG5NNNNG AATT CNNNN33NNNNC TTAA GNNNN5 5NNNNG pAATTCNNNN33NNNNCTTAAp GNNNN5限制性内切酶限制性内切酶（Hae ）GGCCCCGG5NNNNNGG CCNNNNN33NNNNNCC GGNNNNN55NNNNNGG pCCNNNNN33NNNNNCCp GGNNNNN5 5 G A A T T C 3 Restriction Enzyme: EcoRI3 C T T A A G 5 Cleavage5 G A A T T C 3 3 C T T A A G 5 Stick

4、y endsDNA Ligases3 T T A A P5 OH+3 T T A A P5 OH3 C G P5 OH3 T A C G P5 OHACBComplementary ends base-pair5 A A T T 3 3 T T A A 5 OHPPOH+Unpaired B and C5 A A T T 3 3 T T A A 5 DNA ligasesMechanism质粒载体质粒载体 质粒的基本特性质粒的基本特性复制能力复制能力选择标记选择标记 常用的质粒载体常用的质粒载体质粒载体发展的三个阶段质粒载体发展的三个阶段常用的质粒载体常用的质粒载体Plasmids in E.

5、coli cellFrom a lysed E. coli cell: The E. coli genome consists of a single chromosome which is a double-stranded circular DNA molecule with 4,639,221 base pairs. E. coli also contain smaller circular DNA molecules that are free in the cytosol (plamids); see white arrows in figure.分子克隆的步骤分子克隆的步骤分子克隆

6、的基本步骤 归纳起来为5个字：分、切、接、转、筛。 分：克隆目的基因。 切：限制内切酶切开质粒和目的基因。 接:将目的基因连接到载体中，形成重组质粒。 转：将重组质粒转化入感受态细菌中。 筛：筛选重组成功的转化子。分子克隆流程图分子克隆流程图分子探针的制作分子探针的制作缺口平移法缺口平移法 Nick translation随机引物法随机引物法 Random primed DNA labeling体外转录法体外转录法 In vitro transcription末端标记法末端标记法 Endlabeling常用标记物及显示系统常用标记物及显示系统同位素同位素生物素生物素 Biotin地高辛地高辛

7、Digoxigenin同同 位位 素素 32P半衰期半衰期14.3天天 35S半衰期半衰期87.4天天 125I 半衰期半衰期59.7天天 3H半衰期半衰期12.35年年生生 物物 素素 生物素是最早用来替代同位素生物素是最早用来替代同位素的非放射性标记物，其分子量小的非放射性标记物，其分子量小（244 Da），），可与亲合素（可与亲合素（avidin）特异结合特异结合。地地 高高 辛辛 异羟基洋地黄毒苷配基（异羟基洋地黄毒苷配基（Digoxigenin）又称地高辛，是近几年被广泛采用的非放射又称地高辛，是近几年被广泛采用的非放射性标记物之一。性标记物之一。DIG是从植物洋地黄中提取是从植物洋

8、地黄中提取的的半抗原类固醇物质半抗原类固醇物质，通过连接臂（，通过连接臂（Linker-arm）与）与dUTP或或UTP连接，形成连接，形成Dig-dUTP或或Dig-UTP复合物，利用各种标记技术可将复合物，利用各种标记技术可将Dig-dUTP引入新合成的探针引入新合成的探针DNA链中。链中。3. 分子杂交技术分子杂交技术分子杂交的基本策略分子杂交的基本策略常用分子杂交技术常用分子杂交技术分子杂交的基本策略分子杂交的基本策略宽松杂交宽松杂交严格漂洗严格漂洗Tm值的计算值的计算Tm () = 16.6 log M + 0.41 (%G+C) + 81.5 820/L 1.2 (100-h)M

9、the monovalent cation concentration%G+C the base compositionL the duplex length (bp)h the percent interstrand homology(0.7 per one per cent Formamide) 最佳杂交温度的设定最佳杂交温度的设定Th = Tm 25（for DNA probe）Th = Tm 15（for RNA probe）常用分子杂交技术常用分子杂交技术 Southern杂交杂交 (Southern blot hybridization) Northern杂交杂交 (Norther

10、n blot hybridization) 斑点杂交斑点杂交 (Dot blot hybridization) 原位杂交原位杂交 (In situ hybridization)Southern blot hybridizationSouthern blot hybridizationNorthern blot hybridizationNorthern blot hybridizationDot blot hybridizationDot blot hybridizationIn situ hybridization 端粒原位杂交端粒原位杂交In situ hybridizationIn si

11、tu hybridizationIn situ hybridizationIn situ hybridization荧光原位杂交荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization，FISH）是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法。 细胞遗传学技术 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA 靶序列杂交 观察：荧光显微镜 原位观察（细胞、组织）细胞核 彩色探针信号 目的：获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种 基因状态的信息。Fluorescence

12、in situ hybridization（FISH）用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位荧光标记探针探针变性样本DNA变性杂交原理FISH技术的特点技术的特点操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合，操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合， 可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析方法敏感，能迅速得到结果，方法敏感，能迅速得到结果，2424小时就可以完成检测小

13、时就可以完成检测标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测centromeretelomere subtelomerelocusspecificwhole chromosome paintCSPCSP探针：染色探针：染色体着丝粒探针体着丝粒探针GLPGLP探针：位点探针：位点特异性探针特异性探针 WPPWPP探针：全染探针：全染色体或染色体区色体或染色体区域特异性探针域特异性探针FISH探针的种类探针的种类操作流程简图操作流程简图制片制片 预处理预处理 FISH结果分析

14、结果分析 破坏细胞膜利于探针破坏细胞膜利于探针 杂交。杂交。 蛋白酶消化、蛋白酶消化、HCl处理处理 变性变性 杂交杂交 洗涤洗涤 复染复染A. 无须计数的大簇无须计数的大簇团信号（高度扩增）团信号（高度扩增）B. 颗粒状信号（颗粒状信号（R10，高，高度扩增）度扩增）C. 须计数的颗粒须计数的颗粒状信号（状信号（R=3.5，低度扩增）低度扩增）ACBHer-2基因扩增状况基因扩增状况Her-2基因无扩增情况基因无扩增情况红信号数红信号数2，同时绿信号，同时绿信号非整倍体非整倍体R30%的肿瘤细胞全部的细胞膜高强度着色免疫组化（3+）与FISH对比图 40100住院号：177319浸润性导管癌级IHC：+FISH：呈：呈簇团状高度扩增簇团状高度扩增100免疫组化（2+）与FISH对比图 1.30%的肿瘤细胞全部的细胞膜弱至中等着色40住院号：175465浸润性导管癌级IHC：+FISH：Ratio5，中度，中度扩增扩增100免疫组化（2+）与FISH对比图 2.30%的肿瘤细胞全部的细胞膜弱至中等着色40100住院号：176921浸润性导管癌级IHC：+FISH：Ratio1.45，无