小麦WRKY转录因子VIGS基因沉默载体构建及验证

1、小麦WRK转录因子VIGS基因沉默载体构建及验证：WRKYtranscriptionfactorfamilycanhelpimproveplantstresstolerance，whichwidelyexistinvariousplants.AfterTaWRKYgenewassilencedbyVIGSmethod，itwasfoundthattheproportionofsucceedBgtinoculationincreased，andthepercentageofabnormalappressoriadeclined，suchaspapilla.Theresultsindicatedt

2、hatTaWRKYgeneplayedanimportantroleinwheat-Bgtinteraction.小麦白粉病是由布氏白粉菌(Blumeriagraminisf.sp.Tritici)侵染所引起的真菌感染性病害，如遇高温多湿天气病害流行，会使小麦严重受害，导致减产13%-34%1。因此，科学家一方面通过抗病育种，不断培育新的抗病小麦品种来抵御病害，另一方面通过深入的抗病分子机理研究，克隆抗病相关基因、弄清抗病信号通路以及基因工程等技术手段，以达到抗病分子育种的目的。转录因子可以与真核基因启动子区中的顺式作用元件互作，激活或抑制多个下游功能基因转录，从而使植株获得综合改良效果。研究

3、表明，WRK骏录因子家族几乎存在于所有植物中，它们共同含有一段高度保守氨基酸序列WRKYGQK2WRK广泛参与植物种子萌发与休眠、开花、代谢、激素信号转导，还参与抵御生物和非生物胁迫等反应过程。拟南芥AtWRKY3塞因直接调控了植物抗毒素Camalexin的合成3，并且调控大量抗病相关基因的表达4o大豆中GmWRKY58GmWRKY76过表达会造成作物提早开花，表达量的区别对花形态造成不同影响5。水稻中OsWRKY6因的过表达有助于提高作物对病原菌的抗性，同时可直接调控异分支酸合成酶的表达从而增加水杨酸的浓度实现自我调节6。小麦(Triticumaestivum)TaWRKY93r调节作物对渗

4、透压、高盐、干旱和低温等胁迫的耐性7。迄今为止，研究人员已经在大麦8、拟南芥9、大豆10和水稻11等多种植物中都鉴定到不同数量的WRK艘录因子。病毒诱导基因沉默(VIGS-inducedgenesilencing，VIGS)是引起内源mRN借异性降解、引起基因转录沉默的技术。VIGS试验周期短，操作简便，并且无需转化。近年来，在植物基因功能研究中，VIGS技术作为一种简单、快速、高效的反向遗传学技术在禾本科植物基因功能研究中发挥了重要作用12-13。本研究以前期工作获得的TaWRK基因为基础14,利用VIGS技术获得沉默植株，通过对基因沉默前后白粉菌侵染情况进行观察统计，最终确定TaWRK基因

5、在小麦抗白粉病过程中的功能。1 材料和方法1.1 试验材料与试剂抗白粉病品种Brock，由RayJohnson博士惠赠。小麦白粉菌15号生理小种，由中国农业科学院植物保护研究所提供。1.2 沉默TaWRKYVIGS载体构建在目的基因核苷酸序列的非保守区，设计上、下游特异性沉默引物TaWRKY-VIGS-犀口TaWRKY-VIGS-R以抗病小麦Brock总RN蛤成的cDNA?模版，扩增富集沉默片段，将该片段与BSMV:连接构建重组载体BSMV:TaWRKY构建过程参见Li等15。1.3 基因沉默效率检测通过限制性内切酶酶切线性化、体外转录后，获得病毒RNA组分通过摩擦接种方法接种到小麦第2叶上，

6、待接？NH2O（对照1）、BSMVGFP（对照2）和BSMVTaWRKYt小麦第3叶伸展完全，采用抖拂法对各株植株第3叶均匀高密度接种新鲜白粉菌抱子，在相应时间点取叶片，利用半定量PCR方法检测这3组植株中TaWRK鎏因的mRN脉平的水平变化，从而确定TaWRK鎏因沉默的效率。1.4 基因沉默后对小麦抗白粉病表型的影响取接种48，72h和7d后的小麦叶片，用考马斯亮蓝染色方法染色并观察统计白粉菌孢子的生长发育情况，通过与对照白粉菌孢子萌发、畸形胞比例等的对比分析，确定目标基因在抗白粉病过程中的贡献。2 结果与分析2.1 VIGS沉默载体构建根据已获得TaWRK鎏因序列，在基因的非保守区设计添加

7、了NheI识别序列的引物WRKY-V-F（AGCCGCAGCAGCAG）、AACGWRKY-V-RCTTGAAGCTGGGGTCCCTC含TaWRK基因序歹U的重组质粒作为模板，扩增用于构建BSMV1组载体的目的基因片段，扩增结果如图1所示。目的片段大小约为250bp左右，随后将回收后的目的片段进行酶切形成粘性末端，BSM藏体同样经过酶切回收，与目的片段进行连接，通过进一步筛选、验证，挑选阳性克隆送测验证。2.2VIGS技术沉默靶基因后TaWRKY表达水平检测在TaWRK基因的特异性核甘酸序列区段设计引物，扩增一个长227bp的片段构建TaWRK基因沉默载体BSMW:TaWRKY本次沉默试验共

8、设置4个组别，分别为H2O对照组（空白对照）、BSMVGFP对照组（阳i对照）、BSMVPDS对照组（沉默PDS基因）、BSMVTaWRKY式验组（沉默目的基因TaWRKY。为了验证本试验所建立的沉默体系成功有效，分别对各组摩擦接种后约15d的小麦第3叶进行表型观察，结果如图2所示。除BSMV：PDS对照组叶片发生明显白化现象之外，其他组叶片均呈绿色，说明该基因沉默体系构建成功。2.3 TaWRKY基因沉默效率验证为了进一步证实TaWRK鎏因是否被有效沉默，采用半定量PCR勺方法，对沉默后各组植株中TaWRK鎏因的转录水平进行了检测，结果如图3所示。从图中可以看出，摩擦接种后，TaWRKY试验

9、组的mRN冰平明显低于H2O和GFP对照组，说明小麦内源TaWRK鎏因被有效沉默了。另外，在接种重组病毒BSMVGFP后，TaWRK基因的表达也有轻微下调，该现象可能是由于病毒的侵染对植株造成了影响。2.4 TaWRKYS因沉默植株抗病分析为了进一步研究TaWRK鎏因在小麦叶片与白粉菌的互作过程中所起到的调控作用，本研究使用考马斯亮蓝染色法分别对接种48,72h和7d后的GF理、TaWRKY!小麦植株的第3叶进行固定、染色、制片，在显微镜下进行镜检，观察各时间点中，白粉菌萌发形态及生长状态，如图4所示。从图4中可以看出：染菌48h后，TaWRKY1白粉菌抱子萌发状态优于对照组，抱子萌发，芬管伸

10、长，形成附着胞；染菌72h后，TaWRKY：验组白粉菌孢子大量萌发形成次生菌丝，而各对照组中，孢子萌发出现分瓣型畸形附着胞、纤细型畸形附着胞等；染菌7d后，TaWRKY试验组白粉菌孢子大量生成串珠状分生孢子，而各对照组中，仅有少量孢子萌发形成次生菌丝。在镜检观察孢子发育结构的同时，统计各个视野内白粉菌孢子萌发率、畸形率、寄主抗性等参数。统计结果如图5、图6所示。由图可以得出，接种白粉菌48h后，白粉菌对TaWRK鎏因沉默后的植株侵染成功率增加，畸形附着胞比例下降，与GFP对照组相比，TaWRK鎏因沉默组植株白粉菌抱子萌发率上升，畸形附着胞（分瓣型附着胞、纤细型附着胞等）比例下降。3 结论与讨论

11、自1994年，Ishiguro和Nakamura16首次?母适恚?Ipomoeabatatas）中克隆出第一个WRKg白SPF1,研究人员对于植物WRK艘录因子家族开展了大量研究。越来越多的研究结果表明，WRKYg白在植物生长发育，抵御生物以及非生物胁迫等多种生理生化过程中发挥重要作用17。前期工作中，笔者在小麦Brock中分离到一个WRK淡转录因子基因TaWRKY并初步证实该基因参与了小麦的白粉菌胁迫应答反应，但还不能够较确切了解TaWRK鎏因与小麦抗白粉病之间的关系12。关于病毒介导的基因沉默技术已经广泛地应用于基因功能研究18-21，但该方法由于涉及到病毒感染，从而影响对正确结果的判断而备受争议。本研究为了降低这种系统误差，采取了3个对照组，即用GKPg冲液作为摩擦接种介质为阴性对照，用绿色荧光蛋白基因构建丫载体BSMV:GFP编码叶绿素关键酶基因PDS1因构建丫载体BSMW:PDS为两个阳性对照组。结果发现：GKP8冲7和GFP对照组生长正常，没有病毒侵染后