蛋白质的分离纯化-2ppt课件

1、在某在某pHpH时蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋时蛋白质所带正电荷与负电荷恰好相等，即蛋白质的净电荷为零时的白质的净电荷为零时的pHpH称等电点称等电点pIpI）。）。没有其他盐类干扰时没有其他盐类干扰时, , 蛋白质质子供体基团解离出来蛋白质质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pHpH称为等称为等离子点。离子点。u 蛋白质等电点：蛋白质等电点：u 蛋白质等离子点：蛋白质等离子点：u蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带蛋白质溶液能吸收一定波长的紫外光，主要是由带芳香环的氨基酸决定的。其在芳香环的氨基酸决定的。其

2、在280nm280nm处对紫外吸收能力处对紫外吸收能力的强弱顺序为：的强弱顺序为：色（色（ Trp ） 酪（酪（ Tyr ） 苯丙（苯丙（ Phe ）u 蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。蛋白质溶液蛋白质的分子大小属于胶体质点的范围。蛋白质溶液是一种稳定的亲水胶体具有水化层和双电子层）。是一种稳定的亲水胶体具有水化层和双电子层）。u 蛋白质溶液具有胶体的一般性质：布朗运动、丁达尔蛋白质溶液具有胶体的一般性质：布朗运动、丁达尔效应以及不能通过半透膜。效应以及不能通过半透膜。u 半透膜：多是由用赛咯吩半透膜：多是由用赛咯吩cellophanecellophane制造，赛咯制造，赛咯吩膜是半通透的

3、膜，蛋白质等大分子不能透过膜，但小吩膜是半通透的膜，蛋白质等大分子不能透过膜，但小分子可以透过。分子可以透过。 蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果条件发生改变改变, ,破坏了蛋白质的稳定性破坏了蛋白质的稳定性, ,蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质就会从溶液中沉淀出来。蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关蛋白质溶液的稳定性与质点大小、电荷和水化作用有关, ,那么那么任何影响这些条件的因素都会影响蛋白质的稳定性。任何影响这些条件的因素都会影响蛋白质的稳定性。 u沉淀蛋白质的方法有以下几种沉淀蛋白质的方法有以下几种: :

4、u中性盐沉淀法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉中性盐沉淀法、有机溶剂沉淀法、重金属盐沉淀法、生物碱试剂和某些酸类沉淀法、加热变性沉淀淀法、生物碱试剂和某些酸类沉淀法、加热变性沉淀法法. .u盐析：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐盐析：向蛋白质溶液中加入大量的中性盐( (如：硫酸如：硫酸铵铵, ,硫酸钠或氯化钠等硫酸钠或氯化钠等),),使蛋白质表面的电荷被中和，蛋使蛋白质表面的电荷被中和，蛋白质分子脱去水化层而聚集沉淀。白质分子脱去水化层而聚集沉淀。1.1.中性盐沉淀法盐析法）中性盐沉淀法盐析法）u留意：留意：u盐析一般不引起蛋白质变性。当除去盐后盐析一般不引起蛋白质变性。当除去盐后, ,蛋白质蛋白质

5、又可溶解。又可溶解。 2.有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法u 向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂( (如甲醇如甲醇, ,乙醇或丙酮等乙醇或丙酮等) ) 引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒容易凝聚而沉淀。凝聚而沉淀。3.重金属盐沉淀法重金属盐沉淀法u当溶液当溶液pHpH大于等电点大于等电点pIpI时时, ,蛋白质颗粒带负电荷，蛋白质颗粒带负电荷，这样它就容易与重金属离子这样它就容易与重金属离子(Hg2+,Pb2+,Cu2+,Ag+(H

6、g2+,Pb2+,Cu2+,Ag+等等) )结结合成不溶性盐而沉淀。合成不溶性盐而沉淀。u运用运用 ：误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆：误服重金属盐的病人可口服大量牛乳或豆浆等蛋白质进行解救等蛋白质进行解救, ,然后再服用催吐剂排出体外。然后再服用催吐剂排出体外。4.生物生物碱试剂碱试剂和某些酸和某些酸类类沉淀法沉淀法u生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂：生物碱试剂是指能引起生物碱沉淀的一类试剂：u如：鞣酸单宁酸如：鞣酸单宁酸,tannic acid) 钨酸钨酸(tungstic acid，H2WO4)、苦味酸苦味酸(picric acid)即即2,4,6-三硝基酚三硝基酚, 碘化

7、钾等。碘化钾等。u某些酸类某些酸类:u三氯醋酸三氯醋酸, 磺基水杨酸磺基水杨酸sulfosalicylic acid和硝酸等和硝酸等. 当当 pH pIpH pI，蛋白质带正电荷与蛋白质带正电荷与生物碱试剂生物碱试剂某些酸根负离子某些酸根负离子 不溶性沉淀反响5.5.加热变性沉淀法加热变性沉淀法u几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。u当蛋白质处于等电点时当蛋白质处于等电点时, ,加热凝固最完全和最迅速。加热凝固最完全和最迅速。加热变性引起蛋白质凝固的原因：加热变性引起蛋白质凝固的原因：可能是由于热变性使蛋白质天然结构解体，疏水可能是由于热变性使蛋白质天然结构

8、解体，疏水基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点基外露，因而破坏了水化层，同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态。也破坏了带电状态。u蛋白质变性的定义：蛋白质变性的定义：u 环境的变化或是化学处理都会引起蛋白质天然环境的变化或是化学处理都会引起蛋白质天然构象的破坏，并伴随着生物活性的丧失、溶解度的降构象的破坏，并伴随着生物活性的丧失、溶解度的降低以及其它理化常数的改变，这一过程称为蛋白质变低以及其它理化常数的改变，这一过程称为蛋白质变性。性。u蛋白质的复性：蛋白质的复性：u蛋白质的复性当变性因素除去后，变性蛋白质蛋白质的复性当变性因素除去后，变性蛋白质又重新回复到天然构象的现象成

9、为蛋白质的复性。又重新回复到天然构象的现象成为蛋白质的复性。u蛋白质变性后的特性：蛋白质变性后的特性：u 生物活性丧失、侧链基团暴露、理化性质改变、生化性质改变生物活性丧失、侧链基团暴露、理化性质改变、生化性质改变反应名称反应名称试试 剂剂颜色颜色反应有关基团反应有关基团双缩脲反应双缩脲反应NaOH、CuSO2紫色或粉紫色或粉红色红色二个以上肽键二个以上肽键 酚试剂反应酚试剂反应碱性碱性CuSO4及及磷钨酸磷钨酸-钼酸钼酸蓝色蓝色酚基、吲哚基酚基、吲哚基茚三酮反应茚三酮反应茚三酮茚三酮蓝色蓝色自由氨基及羧基自由氨基及羧基1.1.蛋白质样品的前处理蛋白质样品的前处理 2.2.蛋白质粗提液的粗分级

10、分离蛋白质粗提液的粗分级分离3.3.浓缩蛋白质的细分级分离浓缩蛋白质的细分级分离4. 4. 蛋白质的结晶蛋白质的结晶u主要是根据蛋白质主要是根据蛋白质在溶液中的性质不同在溶液中的性质不同对蛋白质进行分离。对蛋白质进行分离。分子大小分子大小溶解度溶解度电荷电荷吸附性质吸附性质对配体分子的生物学亲和力对配体分子的生物学亲和力u主要方法：主要方法：u1 1：透析：透析dialysisdialysis和超过滤和超过滤ultrafiltrationultrafiltration）u2 2：密度梯度区带离心：密度梯度区带离心u3 3：凝胶过滤法：凝胶过滤法1 1：透析和超过滤利用蛋白质分子不能通过半透：透

11、析和超过滤利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质）膜的性质）透析流程透析流程透析装置透析装置超过滤装置超过滤装置u 使用压力或者离心力使蛋白质使用压力或者离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超溶液透过有一定截留分子量的超滤膜半透膜），达到浓缩蛋白滤膜半透膜），达到浓缩蛋白质溶液的目的。质溶液的目的。装好具备密度装好具备密度梯度的介质溶液梯度的介质溶液离心离心收集分离后的各组分收集分离后的各组分参与：混和参与：混和蛋白质样品蛋白质样品离心装置离心装置2：密度梯度区带离心：密度梯度区带离心3：凝胶过滤法：凝胶过滤法u 凝胶过滤是按照蛋白质分子大小进行分离的技术，又凝胶过滤是按照蛋白质分子大小进行分

12、离的技术，又称凝胶层析、分子筛层析或排阻层析。称凝胶层析、分子筛层析或排阻层析。u 凝胶过滤法是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效凝胶过滤法是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。的方法之一。（1凝胶过滤的介质凝胶过滤的介质u 凝胶过滤所用的介质是装在凝胶凝胶过滤所用的介质是装在凝胶柱里的凝胶珠或称凝胶颗粒、凝胶柱里的凝胶珠或称凝胶颗粒、凝胶球）。球）。u其内部是多孔的网状结构，单个其内部是多孔的网状结构，单个凝胶珠本身象个凝胶珠本身象个“筛子筛子”。不同类型凝。不同类型凝胶的筛孔的大小不同胶的筛孔的大小不同 。凝胶柱凝胶柱凝胶过滤分离蛋白质的流程凝胶过滤分离蛋白质的流程开始洗脱后，大

13、分子由于受到的阻力小而先被洗脱出来开始洗脱后，大分子由于受到的阻力小而先被洗脱出来洗脱收集洗脱收集上样上样样品上柱后，样品中的小样品上柱后，样品中的小分子可以进入凝胶微孔，分子可以进入凝胶微孔，但是大分子不能进入。但是大分子不能进入。u这样大小不同的蛋白这样大小不同的蛋白质就被分离开来了。质就被分离开来了。u 依次洗脱收集后，依次洗脱收集后，通过紫外吸收法测定吸通过紫外吸收法测定吸收峰。收峰。u 主要方法：主要方法：u1 1：等电点沉淀和：等电点沉淀和PHPH值控制值控制u2 2：蛋白质的盐溶和盐析：蛋白质的盐溶和盐析u3 3：有机溶剂分级分离法：有机溶剂分级分离法u4 4：改变温度：改变温度

14、1.等电点沉淀和等电点沉淀和PH值控制值控制u即在不改变其它条件的情况下，即在不改变其它条件的情况下，PHPH处于等电点时的蛋白质溶解处于等电点时的蛋白质溶解度达到最低点。而位于等电点两侧的度达到最低点。而位于等电点两侧的PHPH条件下蛋白质的溶解度迅速条件下蛋白质的溶解度迅速上升。上升。u 由于不同的蛋白质等电点不同，因此可以通过控制溶液的由于不同的蛋白质等电点不同，因此可以通过控制溶液的PHPH值值来沉淀混合物中的某种蛋白成分。来沉淀混合物中的某种蛋白成分。u 通过这种办法沉淀出来的蛋白质可以保持天然构象，能重新溶通过这种办法沉淀出来的蛋白质可以保持天然构象，能重新溶解于一定浓度的溶液中。

15、解于一定浓度的溶液中。2.蛋白质的盐溶和盐析蛋白质的盐溶和盐析u盐溶盐溶salting-insalting-in） ：低浓度的中性盐可以：低浓度的中性盐可以增加蛋白质的溶解度，这种现象称为蛋白质的盐增加蛋白质的溶解度，这种现象称为蛋白质的盐溶现象。溶现象。u同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响比单价中性盐大的多。同浓度二价中性盐对蛋白质溶解度的影响比单价中性盐大的多。u盐析盐析salting-outsalting-out） ：当溶液中的离子强度达到：当溶液中的离子强度达到一定的数值时盐浓度高达一定数值时），蛋白质的溶一定的数值时盐浓度高达一定数值时），蛋白质的溶解度开始下降，很多蛋白质可以从水

16、溶液中析出，这种解度开始下降，很多蛋白质可以从水溶液中析出，这种现象称为盐析。现象称为盐析。3.有机溶剂分级分离法有机溶剂分级分离法u 与水互溶的有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮等）与水互溶的有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮等） 能能使蛋白质在水中的溶解度显著降低，在室温下，这些有机使蛋白质在水中的溶解度显著降低，在室温下，这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。这种沉淀的主要原因是有机溶剂的加入改变了介质这种沉淀的主要原因是有机溶剂的加入改变了介质的介电常数。的介电常数。4.改变温度分离蛋白质改变温度分离蛋白质040oC之间：大部分球状蛋白质的溶解度随

17、温度升高而增加，之间：大部分球状蛋白质的溶解度随温度升高而增加， 例外：例外：025oC，人的血红蛋白溶解度随温度上升而降低。，人的血红蛋白溶解度随温度上升而降低。4050oC以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性。以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性。u一般蛋白质的分级分离操作一般都在一般蛋白质的分级分离操作一般都在04oC04oC温度下进行。温度下进行。主要方法：主要方法： 电泳电泳 离子交换层析离子交换层析电泳概述电泳概述u由于蛋白质在指定的由于蛋白质在指定的PHPH溶液中所带电荷和分子量不同，形状不溶液中所带电荷和分子量不同，形状不同，在电场中泳动速度不同。同，在电场中泳动速度不同。

18、u因此根据这一原理就可以从蛋白质混合液中将各种蛋白质分离因此根据这一原理就可以从蛋白质混合液中将各种蛋白质分离开来，所以电泳技术已成为分析、分离蛋白质的重要手段之一。开来，所以电泳技术已成为分析、分离蛋白质的重要手段之一。1.1.聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylaminde gel electrophoresis) PAGE电泳电泳u 它以聚丙烯酰胺它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物，一般凝胶为支持物，一般制成凝胶柱或凝胶板制成凝胶柱或凝胶板不连续体系）。不连续体系）。凝胶的浓度孔径大小）、凝胶的浓度孔径大小）、缓冲液组分和离子强度、缓冲液组分和离子强度、pHpH以及电场强度都

19、是不同的以及电场强度都是不同的浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品浓缩成很薄的起始区带样品浓缩成很薄的起始区带0.1mm0.1mm）分离成单区带分离成单区带SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)(SDS-PAGE)u SDS-PAGE: SDS-PAGE:是用是用SDSSDS十二烷基硫酸钠和还原剂通常为巯基十二烷基硫酸钠和还原剂通常为巯基乙醇先对待分离的蛋白质样品进行预处理加热煮沸乙醇先对待分离的蛋白质样品进行预处理加热煮沸3 35 5分钟）。分钟）。u 通过加热和通过加热和SDSSDS可以使蛋白质变性：多亚基的蛋白质解离为单可以使蛋白质变性：多亚基的蛋白质解离为单亚

20、基。二硫键被切断。亚基。二硫键被切断。u SDS SDS是带有负电荷的分子，所有结合是带有负电荷的分子，所有结合SDSSDS的蛋白质的形状近似于的蛋白质的形状近似于长的椭圆棒，全部带上了大量的负电荷。长的椭圆棒，全部带上了大量的负电荷。u 电泳时电泳时SDS-SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响全部由负极向正极移动），而主要取决于蛋白电荷和形状的影响全部由负极向正极移动），而主要取决于蛋白质分子量。质分子量。 浓缩胶浓缩胶分离胶分离胶样品样品SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置聚丙烯酰胺凝胶电泳装置点样点样浓缩胶浓缩

21、胶分离胶分离胶样品样品SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置聚丙烯酰胺凝胶电泳装置2.2.毛细管电泳毛细管电泳 泛指高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳泛指高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳和毛细管电泳。和毛细管电泳。 用途：分离多种生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白质、用途：分离多种生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白质、DNA片段例如合成的寡核苷酸和核酸以及多种小分子，如药片段例如合成的寡核苷酸和核酸以及多种小分子，如药物、甚至金属离子。用样量物、甚至金属离子。用样量530l 1mg/ml溶液。溶液。3.3.等电聚焦电泳等电聚焦电泳u等电聚焦或称电聚焦，是一种高分辨率的

22、蛋白质分离技术，它等电聚焦或称电聚焦，是一种高分辨率的蛋白质分离技术，它也可用于蛋白质等电点的测定。也可用于蛋白质等电点的测定。u蛋白质混合物是在具有蛋白质混合物是在具有pHpH梯度的介质如浓蔗糖溶液中进行梯度的介质如浓蔗糖溶液中进行电泳的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦停留在等于电泳的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦停留在等于其等电点的其等电点的pHpH梯度处，并形成一个很窄的区带。梯度处，并形成一个很窄的区带。u等电聚焦可以把人的血清分成等电聚焦可以把人的血清分成4040多个条带。此技术特别适用于多个条带。此技术特别适用于同功酶的鉴定。只要它们的同功酶的鉴定。只要它们的pIpI

23、有有0.020.02甚至甚至0.020.02pHpH单位的差别单位的差别就能分开。就能分开。u 实际上是利用缓冲液在实际上是利用缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个方向制造一个pHpH梯度。所用梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质。称之两性电解质。等电聚焦电泳装置等电聚焦电泳装置u 当蛋白质样品在这样的当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的都将迁移至与它的pI pI 相一相一致的致的pHpH处，具有不同处，具有不同pIpI的各的各种蛋

24、白质最后都迁移至凝胶种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的中相应的pHpH处，达到分离的处，达到分离的目的。目的。4.4.蛋白质的双向电泳蛋白质的双向电泳two-dimensional two-dimensional electrophoresiselectrophoresis）u 将等电聚焦电泳与将等电聚焦电泳与SDS-PAGESDS-PAGE结合起来的电泳技术。结合起来的电泳技术。电泳方向电泳方向电泳方向电泳方向等电聚焦电泳等电聚焦电泳SDS-PAGEu 双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在出蛋白在pIpI上的差异，

25、而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。u 所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。电点相同而分子量不同的蛋白质分开。u是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。特种多缓冲交换特种多缓冲交换剂剂PH降低降低混和蛋白质样品混和蛋白质样品特种多缓冲液特种多缓冲液特种多特种多缓冲液缓冲液搜集搜集特种多特种多缓冲液缓冲液搜集搜集特种多特种多缓冲液缓冲液依次收集不同的蛋白组分依次收集不同的蛋白

26、组分5.5.层析聚焦层析聚焦(P310)(P310)u 填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。支持介质：支持介质： 对蛋白质交换容量大对蛋白质交换容量大阳离子交换剂阳离子交换剂阴离子交换剂阴离子交换剂CM纤维素纤维素(弱酸型弱酸型)P-纤维素纤维素(中强酸型中强酸型)SE- 纤维素纤维素(强酸型强酸型)SP-Sephadex(强酸型强酸型)AM纤维素纤维素(弱碱型弱碱型)PAB-纤维素纤维素(弱碱型弱碱型)DEAE-纤维素纤维素(中强碱型中强碱型)DEAE-Sephadex(中强碱型中强碱型)TEAE-纤维素纤维素(强碱型强碱型)Q

27、AE-Sephadex(强碱型强碱型)6.6.离子交换层析离子交换层析(P310)(P310)以阳离子交换型树脂为例以阳离子交换型树脂为例u将带有耐酸性非常强的磺酸根将带有耐酸性非常强的磺酸根SO3-NaSO3-Na（以盐的形式出（以盐的形式出现的强阳离子交换树脂固定相填充到层析柱中。现的强阳离子交换树脂固定相填充到层析柱中。u将含有样品的流动相加入层析柱中，样品中带有正电荷将含有样品的流动相加入层析柱中，样品中带有正电荷的蛋白质的蛋白质X X，通过静电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，通过静电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，结果结果X X与与NaNa交换阳离子交换），形成交换阳离子交换），

28、形成SO3-XSO3-X，蛋白质就结，蛋白质就结合到了层析柱上。合到了层析柱上。u在样品与树脂充分交换后，可通过提高流动相中的盐浓在样品与树脂充分交换后，可通过提高流动相中的盐浓度，或改变流动相的度，或改变流动相的pHpH，或是同时采用这两种方法，就可以，或是同时采用这两种方法，就可以将结合于树脂上的蛋白质将结合于树脂上的蛋白质X X成分，按照它们与树脂结合的强成分，按照它们与树脂结合的强弱程度不同逐一地洗脱下来。弱程度不同逐一地洗脱下来。结合到层析柱上的蛋白质的洗脱有不同的洗脱方式：结合到层析柱上的蛋白质的洗脱有不同的洗脱方式： 洗脱方式洗脱方式恒定浓度洗脱恒定浓度洗脱改变盐浓度或改变盐浓度

29、或pH洗脱洗脱跳跃式分段洗脱跳跃式分段洗脱渐进式连续改变渐进式连续改变(梯度洗脱梯度洗脱)简单型混合器简单型混合器复合型混合器复合型混合器u 利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的。力和解吸性质不同而达到分离目的。u 典型的吸附剂：硅胶典型的吸附剂：硅胶, ,氧化铝和活性炭等氧化铝和活性炭等. .u 主要用来分离非离子、水不溶性化合物主要用来分离非离子、水不溶性化合物 亲和层析亲和层析(affinity chromatography)(affinity chromatography)：是利用蛋白质分子对其配体分

30、：是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力子特有的识别能力, , 即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。方法。 经常只需一步处理即可将某种所需蛋白质从复杂混合物中分离出经常只需一步处理即可将某种所需蛋白质从复杂混合物中分离出来，纯度相当高。来，纯度相当高。u把某一待纯化蛋白质的特异配体通过适当的化学把某一待纯化蛋白质的特异配体通过适当的化学反应共价地连接到像琼脂糖凝胶这一类的载体表面。反应共价地连接到像琼脂糖凝胶这一类的载体表面。u向含有载体的层析柱中加入样品，样品中待纯化向含有载体的层析柱中加入样品，样品中待纯化的蛋白质由于与载体上的配体结合

31、而被吸附，而其它的蛋白质由于与载体上的配体结合而被吸附，而其它蛋白质和杂质成分通过平衡液的洗涤可以被除去。蛋白质和杂质成分通过平衡液的洗涤可以被除去。u被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液被特异结合的蛋白质可用含游离的相应配体溶液高浓度洗脱液洗脱高浓度洗脱液洗脱( (亲合洗脱亲合洗脱) )并进行收集。并进行收集。样品样品层析柱层析柱凝胶上的配体凝胶上的配体样品中待分离的的蛋白成分样品中待分离的的蛋白成分u 蛋白与凝胶上的配体特异结合在凝胶球上，其余未结合的蛋白与凝胶上的配体特异结合在凝胶球上，其余未结合的样品成分被平衡液洗脱下来。样品成分被平衡液洗脱下来。样品样品凝胶上的配体凝胶上的配体

32、样品中能与配体特异结合的蛋白成分样品中能与配体特异结合的蛋白成分高浓度的蛋白配体或者是类似物高浓度的蛋白配体或者是类似物高浓度的蛋白配体或者是类似物高浓度的蛋白配体或者是类似物分子大小：分子大小：溶解度：溶解度：电荷：电荷：吸附性质：吸附性质：对配体分子对配体分子的亲和力：的亲和力：透析和超过滤、密度梯度区带离心、凝胶过滤法透析和超过滤、密度梯度区带离心、凝胶过滤法等电点和等电点和PHPH值控制、盐溶盐析、有机溶剂分级分离、变温度值控制、盐溶盐析、有机溶剂分级分离、变温度电泳、离子交换层析电泳、离子交换层析亲和层析亲和层析u 用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量用化学分析方法测定出蛋

33、白质中某一微量元素的含量, ,可以计算出蛋白质的最低相对分子质量。可以计算出蛋白质的最低相对分子质量。u如如FeFe，并假设每个蛋白质分子中只有，并假设每个蛋白质分子中只有1 1个个FeFe原子，则原子，则由此可算出蛋白质的最低相对分子质量。由此可算出蛋白质的最低相对分子质量。例如例如: :某种蛋白含铁量为某种蛋白含铁量为0.335%, 0.335%, 其最低相对分子质量其最低相对分子质量( (假设此假设此蛋白只含有一个铁原子如肌红蛋白蛋白只含有一个铁原子如肌红蛋白) )可按下式计算出可按下式计算出: : 若此蛋白含若此蛋白含4 4个铁原子如血红蛋白）个铁原子如血红蛋白） ，那么：，那么：Mr

34、 = 16 700Mr = 16 7004 486 60086 600最低相对分子质量最低相对分子质量Mr铁的原子质量铁的原子质量铁的百分含量铁的百分含量=55.80.335 100 =100 = 16 700即某蛋白的真实即某蛋白的真实 Mr = 16 700 Mr = 16 700n n （n n为含有的铁原子的数目）为含有的铁原子的数目）渗透现象：溶剂分子由纯溶剂或稀溶液向溶液渗透现象：溶剂分子由纯溶剂或稀溶液向溶液或浓溶液单方向的净移动现象。或浓溶液单方向的净移动现象。半透膜半透膜溶剂溶剂蛋白质溶液蛋白质溶液渗透压渗透压h h小分子可以通过，但蛋白小分子可以通过，但蛋白质等大分子不能通

35、过。质等大分子不能通过。Mr = RTlim (/c)c 0R: 气体常数；气体常数； T：绝对温度；：绝对温度；：渗透压；：渗透压； c: 溶质的浓度。溶质的浓度。 本卷须知：尽量采用等电点或者接近等电点的缓冲溶液做为半透本卷须知：尽量采用等电点或者接近等电点的缓冲溶液做为半透膜内外的溶剂，以避免膜内外的溶剂，以避免PHPH值对渗透压的影响。值对渗透压的影响。 渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点：渗透压法测定蛋白质分子量的优缺点： 优点：装置简单，准确度相对高。优点：装置简单，准确度相对高。 缺陷：不能区别所测蛋白质溶液中的蛋白质样品是否均一。如果缺陷：不能区别所测蛋白质溶液中的蛋白质样品是否

36、均一。如果溶液含多种蛋白质成分，那么测出的是几种蛋白质的平均分子量。溶液含多种蛋白质成分，那么测出的是几种蛋白质的平均分子量。u 分散平移扩散）：由于浓度差引起的溶质分子的净分散平移扩散）：由于浓度差引起的溶质分子的净迁移。迁移。u 扩散系数扩散系数D D：在数值上等于当浓度梯度为一个单位时，：在数值上等于当浓度梯度为一个单位时，在一秒钟内通过在一秒钟内通过1cm21cm2面积所扩散的溶质量。面积所扩散的溶质量。u 扩散系数扩散系数D D的特点：的特点：(2)(2)扩散系数一般不单独用来决定扩散系数一般不单独用来决定Mr ,Mr ,但如后面所说的与沉降系但如后面所说的与沉降系数结合起来数结合起

37、来, ,可以给出蛋白质的精确相对分子质量。可以给出蛋白质的精确相对分子质量。(1)(1)随随 MrMr的增加而降低的增加而降低, ,但扩散系数对但扩散系数对Mr Mr 的变化并不敏感。的变化并不敏感。 需转速为需转速为60,00060,00080,000rpm80,000rpm的超速离心机的超速离心机 测测Mr常用两种方法：常用两种方法：沉降速度法沉降速度法沉降平衡法沉降平衡法u沉降：蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用沉降：蛋白质分子在溶液中受到强大的离心力作用时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就时，如果蛋白质的密度大于溶液的密度，蛋白质分子就会发生沉降，沉降的速度与蛋白质的分

38、子大小、外形、会发生沉降，沉降的速度与蛋白质的分子大小、外形、密度以及溶液的性质有关。密度以及溶液的性质有关。u 沉降系数沉降系数(s):(s):单位离心场的沉降速度。单位离心场的沉降速度。液面液面界面界面溶剂溶剂坪区坪区池底池底 界面移动的速度即沉降速度，溶质的相对分子量越大，则界界面移动的速度即沉降速度，溶质的相对分子量越大，则界面移动越快，若溶液中有几种溶质，则离心之后就会出现几个界面。面移动越快，若溶液中有几种溶质，则离心之后就会出现几个界面。界面移动的速度可以借助适当的光学系统来观察。界面移动的速度可以借助适当的光学系统来观察。如人血红蛋白沉降系数如人血红蛋白沉降系数s=4.46Ss

39、=4.46S，即，即4.464.4610101313秒。秒。 为了比较起见，在不同温度和溶剂中测得的沉降系数需要换算为了比较起见，在不同温度和溶剂中测得的沉降系数需要换算成标准条件下的成标准条件下的s s值。沉降系数的标准条件定为值。沉降系数的标准条件定为2020C,C,溶剂为水。溶剂为水。校正后的沉降系数用校正后的沉降系数用s20s20，w w表示。表示。 大部分生物大分子的沉降系数介于110-13到20010-13秒的范围。因此：把10-13秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位或称沉降系数单位，用S(大写)来表示。 即：1S10-13秒Mr =RTsD1V）R : 气体常数气体常数8.314

40、107ergsmol -1 度度-1）T : 绝对温度绝对温度D : 扩散常数可用试验求得）扩散常数可用试验求得）V : 蛋白质的偏微比容蛋白质的偏微比容m3g-1）: 溶剂密度溶剂密度20，gml-1） s : 沉降系数可以根据沉降速度和离心力求得）沉降系数可以根据沉降速度和离心力求得）蛋白质分子量与沉降系数的关系蛋白质分子量与沉降系数的关系u利用较低转速利用较低转速800020000 r/min800020000 r/min进展。由于分子颗粒进展。由于分子颗粒沉降造成浓度梯度，因而产生了扩散作用。沉降造成浓度梯度，因而产生了扩散作用。x2x1离心力离心力离心池离心池轴心轴心液面液面扩散力扩

41、散力蛋白质的沉降平衡蛋白质的沉降平衡 2RTdln(c2/c1) (1-)2(x22-x12)Mr=R : 气体常数气体常数8.314107ergsmol -1 度度-1）T : 绝对温度绝对温度V : 蛋白质的偏微比容蛋白质的偏微比容m3g-1）: 溶剂密度溶剂密度20，gml-1）: 转子的角速度。转子的角速度。c1、c2:距离旋转中心距离旋转中心x1和和x2处的蛋白质浓度。处的蛋白质浓度。x2x1离心力离心力轴心轴心液面液面扩散力扩散力u利用凝胶过滤可以把蛋白质混合物按分子的大小分离开来利用凝胶过滤可以把蛋白质混合物按分子的大小分离开来洗脱过程洗脱过程凝胶球凝胶球u 如果某种蛋白质与一理

42、想的非水化球体具有相同的过柱速度即如果某种蛋白质与一理想的非水化球体具有相同的过柱速度即相同的洗脱体积相同的洗脱体积elution volumeelution volume）, ,则认为这种蛋白质具有与此则认为这种蛋白质具有与此球体相同的半径球体相同的半径, ,称蛋白质分子的斯托克半径。称蛋白质分子的斯托克半径。 u 因此因此, ,标准蛋白质标准蛋白质( (已知已知MrMr和斯托克半径和斯托克半径) )和待测蛋白质必须具有和待测蛋白质必须具有相同的分子形状相同的分子形状( (接近球体接近球体),),否则不能得到比较准确的否则不能得到比较准确的MrMr。留意：分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用留意：分子形状为线形的或与凝胶能发生吸附作用的蛋白质的蛋白质, ,则不能用此方法测定则不能用此方法测定MrMr。Gel filtration column1966年年Andrews提出了一个经验公式提出了一个经验公式 VeVo= a - blgMr其中：其中：VeVe为洗脱体积；为洗脱体积；VoVo为外水体积为外水体积 Mr Mr为相对分子质量；为相对分子质量；a a和和b b为常数为常数方法简便，仪器简单。方法简便，仪器简单。不纯样品亦可，只要找出活性不纯样品亦可，只要找出活性峰位置峰位置VeVe即可。即可。lgMrVea 1 Ve