SPE_HPLC法测定马破伤风免疫球蛋白F_ab_2中TritonX_100残留

1、SPE HPLC 法测定马破伤风免疫球蛋白 F( ab) 2 中TritonX 100 残 留 量白文莉1 ，高家敏2 ，余振喜2 *( 1. 昆明市食品药品检验所，昆明 650032; 2. 中国食品药品检定研究院，北京 100050)摘要 目的: 建立固相萃取高效液相色谱( SPE HPLC) 法测定马破伤风免疫球蛋白 F( ab) 2 中灭活剂 Triton X 100 的残留量。方法: 采用 Oasis 固相萃取小柱对样品进行预处理，以 水 和 5% 甲 醇 为 淋 洗 剂，以甲醇为洗脱剂，收集甲醇洗脱物用于 1HPLC 分析。采用 ZOBAX Extend C18 色谱柱( 4. 6

2、 mm 150 mm，5 m) ，流动相为甲醇 水( 80 20) ，流速 1. 0 mLmin，检测波长 230 nm，柱温 30 ，进样量 10 L。结果: Triton X 100 浓度在 0. 56 55. 34 gmL 1 范围内，与峰面积线性关系良好( r = 0. 9998) ; 检测限( S / N = 3) 为 2. 03 ng，定量限( S / N = 10) 为 4. 06 ng; 提取回收率为 91. 8% 。结论: 本方法操作简便、准确、重复性好，可用于 Triton X 100 的残留量测定。关键词: 马破伤风免疫球蛋白 F( ab) 2 ; Triton X 10

3、0; 灭活剂; 裂解剂; 辛基苯氧基聚 2 乙氧基乙醇; 杂质残留检测; 固相萃取; 高效液相色谱法中图分类号: 917文献标识码: A文章编号: 0254 1793( 2014) 07 1251 05Determination of Triton X 100 residues in the equine antitetanusimmunoglobulin F( ab) 2 by SPE HPLCBAI Wen li1 ，GAO Jia min2 ，YU Zhen xi2*( 1 Kunming Institute for Food and Drug Control，Kunming 65003

4、2，China;2 National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050，China)AbstractObjective: To establish a SPE HPLC method for the determination of Triton X 100 residues in e-quine antitetanus immunoglobulin F( ab) 2 Methods: Samples were pre treated on Oasis HLB SPE column，thencleaned up by wat

5、er and 5% methanol，and finally extracted by methanol The analysis of extracts was performedon a ZOBAX Extend C18 column( 4. 6 mm 150 mm，5 m) with a mobile phase consisting of methanol water( 80 20，v / v) at a flow rate of 1. 0 mLmin 1 The column temperature was set at 30 and the injection volumewas

6、10 L Triton X 100 was detected at the wavelength of 230 nm with a DAD detection esults:The estab-lished HPLC method resulted in sharp and symmetric peaks of Triton X 100，whereas the calibration curve ofTriton X 100 displayed a good linearity within the concentration of 0. 56 55. 34 gmL 1 ( r = 0. 99

7、98 ) TheLOD and LOQ were 2. 03 ng and 4. 06 ng，respectively Specificity，precision，accuracy，stability and robustness wereacceptable The extraction recovery was 91. 8% Conclusion: The results indicate that the established method isconvenient，accurate and reproducible，which can be used in the analysis

8、of Triton X 100 residues in equine ant-itetanus immunoglobulin F( ab) 2 Key words: equine antitetanus immunoglobulin F( ab) 2 ; Triton X 100; inactivator ; split agent; octylphenoxypoly-ethoxyethanol; impurity residue detection; SPE; HPLCTriton X 100 是一种非离子型表面活性剂，其化学名称为辛基苯氧基聚 2 乙氧基乙醇( octylphe-noxyp

9、olyethoxyethanol) 。Triton X 100 在 生 物 制 品中常作为灭活剂和裂解剂使用，本身具有一定的毒*通讯作者 Tel: E mail: yuzhx nicpbp org cn第一作者 Tel: E mail: baiwenli77 sina com药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34( 7) 1252 性1 3，必须在后续工艺中除去，并在最终产品中对其残留量进行检测。中国药典 2010 年版 三 部 对 一 些产品中 Triton X 100 的残留量作了明确规定4， 规定裂解剂残 留

10、量 应 小 于 15. 0 g mL 1 ，但 尚 未 收载统一的方法对其进行测 定。 当 前 用 于 测 定 Triton X 100 含量的方法很多，如紫外分光光度 法5、荧光分 光 光 度 法6、化 学 发 光 法7 和 高 效 液 相色谱法8 11等。其中紫外、荧光和化学发光法的 选择性低，因为其他共存的表面活性剂会对紫外、荧 光法的测定产生干扰，金属离子的存在会对化学发 光法的测定产生干扰。液相色谱法有很好的分离能 力和较 高 的 选 择 性，可 满 足 不 同 样 品 中 Triton X 100 含量的测定要求。但要测定马破伤风免疫球蛋 白 F( ab) 2 中 Triton X

11、 100 的残留量，在进行液相色谱分析前，必须采取合适的前处理方法纯化样品。本文先 采 用 固 相 萃 取 ( Solid Phase Extraction，简 称 SPE) 技术12 13纯化样品，再利用 HPLC 法对 Triton X 100 的残留量进行测定，并进行了系统的方法学 考察，评价了 SPE 技术用于马破伤风免疫球蛋白 F( ab) 2 样品预处理的实用性。50 mg，精密称定，置 50 mL 量瓶中，加甲醇 5 mL 振摇使溶解，用水稀释至刻度，摇匀，即得。2. 2. 2对照品溶 液 1分别精密量取对照品储备 液适量，加甲醇稀释制成 0. 5、2. 5、5. 0、10. 0

12、、25. 0、50. 0 gmL 1 的对照品溶液，即得。2. 2. 3对照品溶 液 2分别精密量取对照品储备 液适量，加阴 性 样 品 溶 液 ( 即 未 添 加 Triton X 100的马破伤风免疫球蛋白 F ( ab) ) 稀 释 制 成 1. 0、25. 0、10. 0、20. 0、50. 0、100. 0 g mL 1 的 对 照 品 溶液，即得。2. 2. 4供试品溶液 1精密量取未去除灭活剂的马破伤风免疫球蛋白 F( ab) 2 1. 0 mL，置 100 mL 量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀; 精密量取 10. 0 mL，置 100 mL 量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即

13、得。2. 2. 5供试品溶 液 2直接取去除灭活剂的马破 伤风免疫球蛋白 F( ab) 2 。2. 3样品预处理将 Oasis HLB 小柱依次用甲醇 1 mL 与水 1 mL冲洗进行活化平衡，备用。分别精密量取供试品溶液 1 和 2 以及对照品溶液 2 各 0. 5 mL，分置已活化 平衡的 Oasis HLB 小柱上，依次用水 1 mL 和 5% 甲 醇 1 mL 冲 洗 小 柱，待 溶 剂 滴 尽 后，精 密 量 取 甲 醇1. 0 mL 洗脱小柱，收集洗脱液，备用。1仪器与材料Aglient 1200 高 效 液 相 色 谱 仪，配 有 在 线 脱 气机、四 元 泵、DAD 检 测 器

14、、自 动 进 样 器、柱 温 箱 和Chemstations 工作站; Mettler AE 240 电 子 天 平; Wa-ters Oasis HLB SPE 小柱( N 乙烯基吡咯烷酮 二乙烯苯共聚物填料，1cc 30 mg) 。Triton X 100 对照品 ( 购 自 Sigma 公 司，批 号:118K0095) ; 未去除灭活剂的马破伤风免疫球蛋白 F( ab) 2 、去除灭活剂的马破伤风免疫球蛋白 F( ab) 2和未添加 Triton X 100 的马破伤风免疫球 蛋 白 F( ab) 2 ( 均由玉溪九洲生物技术有限责任公司提供，蛋白浓度均 小 于 50 g L 1 )

15、; 甲 醇 为 色 谱 纯，水 为超纯水。2方法33. 1结果方法专属性分别取甲醇和对照品溶液 1 中 5. 0 g mL 1的溶 液，照上述色谱条件，注 入 色 谱 仪，得 色 谱 图1 A、C。分别 取 阴 性 样 品 溶 液、对 照 品 溶 液 2 中 110. 0 gmL 的溶液和供试品溶液 1，按“2. 3 ”项下方法操作后，照上述色谱条件，注入色谱仪，得色谱图 1 B、D、E。由 图 1 可 知，Triton X 100 的 保 留时间约为 7. 1 min，甲醇溶剂和阴性样品溶液在 Triton X 100 相应位置无色谱峰出现，对主峰无干 扰。供试品溶液 1 在 Triton

16、X 100 对 照 品 相 应 位 置有色谱峰出现，Triton X 100 峰与相邻峰的分离 度大于 1. 5。对照品溶液 1 直接进样测定与对照品 溶液 2 按“2. 3”项下方法操作后，进样测定，色谱图 无明显差异。1. 1色谱条件色谱柱: ZOBAX Extend C18 柱( 4. 6 mm 150mm，5 m) ; 流 动 相: 甲 醇 水 ( 80 20 ) ; 流 速: 1. 0mLmin 1 ; 检测波长: 230 nm; 柱温: 30 ; 进样量:10L。在 上述色谱条件 下，理 论 塔 板 数 按 TritonX 100 峰计 算 应 不 低 于 2500，Triton

17、X 100 峰 与相邻峰之间的分离度应大于 1. 5。线性关系考察标准曲线 13. 23. 2. 1取 对 照 品 溶 液 1 中 的 各 浓 度溶液，照上述色谱条件，注入色谱仪，以进样时浓度( 即对照品溶液的浓度) 为横坐标 ( X) ，平均峰面积 为纵坐标( Y) 作回归分析，得回归方程为:1. 22. 2. 1溶液的制备对照品储备液 取 Triton X 100 对照品约药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34( 7) 1253 Y = 6. 610X 0. 5519 r = 0. 9999( n = 6)结果表明，Triton X 100 进 样 浓 度 在 0

18、. 51 55. 06gmL 1 范围内，与峰面积线性关系良好。3. 2. 2标准曲线 2取 对 照 品 溶 液 2 中 的 各 浓 度溶液，按“2. 3”项 下 方 法 操 作，照上述色谱条件，注入色谱仪，以进样时浓度( 即 SPE 处理后浓度) 为横坐标( X) ，平均峰面积为纵坐标( Y) 作回归分析，得回归方程为:Y = 6. 218X 0. 8390 r = 0. 9998( n = 6)结 果 表 明， TritonX 100进 样 浓 度 在0. 56 55. 34 gmL 1 范围内，与峰面积线性关 系良好。3. 3检测限与定量限取对照品溶液 1 中浓度约为 2. 5 g mL

19、 1 的 溶液，适当稀释并进样测定，当 信 噪 比 ( S / N ) 为 3 时，测得 检 测 限 为 2. 03 ng; 当 信 噪 比 ( S / N ) 为 10 时，测得定量限为 4. 06 ng。3. 4准确度按“2. 2. 2”项下方法，配制浓度为 5、10、20 gmL 1 的对照品 溶 液。分别精密量取各浓度的对照 品溶液 5. 0 mL( n = 3) ，分置于锥形瓶中，挥干，精密加入阴性样品溶液 5. 0mL，混合摇匀，按“2. 3”项下方法操作，进样测定峰面积 A。3. 4. 1提取回收率 将上述测得的各峰面积 A，代入不经 SPE 处理所得的标准 曲 线 ( 即“3.

20、 2. 1 ”项 下的标准 曲 线 1 ) ，得 测 得 浓 度 1，计算得到提取回收 率，结果见表 1。表 1 提取回收率测定结果( n = )Tab 1 esults of extraction recovery平均回收率( average recovery)/ %添加浓度( added)/ gmL 1测得浓度 1( measured 2)/ gmL 1回收率( recovery)/ %SD/ %92. 30. 95. 4845. 09192. 85. 4845. 01191. 45. 4845. 08792. 810. 97910. 07391. 892. 81. 610. 97910.

21、 12492. 210. 97910. 36794. 4图 1 高效液相色谱图Fig 1 HPLC chromatogramsA. 甲醇溶剂( methanol solvent)B. 阴 性 样 品 溶 液 ( negative samplesolution)C. 对照品溶液 1( reference solution 1 )D. 对照品溶液 2( reference solution 2) E. 供试品溶液 1( sample solution 1)21. 27719. 07689. 790. 22. 721. 27718. 74188. 121. 27719. 75192. 8药物分析杂志

22、 Chin J Pharm Anal 2014，34( 7) 1254 3. 4. 2方法回收率 将上述测得的各峰面积 A，代3. 7. 2洗脱体积精密度测定 取对照品溶液 2 中浓度约为 10 gmL 1 的对照品溶液，按“2. 3”项下方法操作，取洗脱液精密称定 ( n = 6 ) ，计 算 体 积 回收率为 101. 5% ，SD 为 0. 3% 。表明溶液过柱后的体积变化很小，直接进样测定，可以满足准确定量的要求。入经 SPE 处理所得的标准曲 线 ( 即“3. 2. 2 ”项 下 的标准曲线 2) ，得测得浓度 2，计算得到方法回收率，结果见表 2。表 2 方法回收率测定结果( n

23、= )Tab 2 esults of method recovery不同上样量线性考察 取对照品溶液 2 中3. 7. 3添加浓度( added)/ gmL 1测得浓度 2( measured 2)/ gmL 1回收率( recovery)/ %平均回收率( average recovery)/ %SD/ % 1浓度约为 10 gmL的对照品溶液，分别向 OasisHLB 小柱进样 0. 2、0. 5、1. 0、1. 5、2. 0 mL，其他操作同“2. 3”项 下，进 样 测 定。以不同的进样体积为横 坐标( X) ，峰面积为纵坐标( Y) 作回归分析，得回归方程为:Y = 63. 3054

24、X + 1. 4740 r = 0. 9996( n = 5)5. 4845. 504100. 499. 81. 15. 4845. 408398. 65. 4845. 498100. 3 1结果表 明，浓 度 约 为 10 g mL 样 品 溶 液，使 用Oasis HLB 1cc 固相提取小柱时可以在 0. 2 2. 0 mL之间上样。10. 97910. 79298. 499. 51. 610. 97910. 85598. 910. 97911. 113101. 23. 8样品测定结果取对照品溶液 2 中浓度约为 10 gmL 1 的对21. 27720. 37195. 796. 32.

25、 7照品溶液、3 批供试品溶液 1 和 3 批供试品溶液 2，按“2. 3”项下方法操作，取洗脱液进样测定，按外标法以峰面积计算。结果 3 批供试品溶液 1 中 TritonX 100 的残留分别为 3. 64、3. 60、3. 53 mgmL 1 ，3 批供试品溶液 2 均未检出 Triton X 100。21. 27720. 01194. 0 21. 277 21. 088 99. 1 3. 5精密度3. 5. 1仪器重复性 取对照品溶液 2 中浓度约为10 gmL 1 的对照品溶液，按“2. 3”项下方法操作后，连续进样 5 次，峰面积的 SD( n = 5) 为 0. 61% ，表明仪

26、器精密度良好。44. 1讨论色谱条件的选择Triton X 100 的最大吸收波长为 225 nm，兼顾方法重复性 按“2. 2. 3 ”项下方法操作，平3. 5. 2考虑减少杂质和溶剂末端吸收的影响，选定 230 nm为检测 波 长。比 较 甲 醇 水 ( 80 20 ) 和 乙 腈 水行配制 6 份浓度 约 为 10 g mL 1 的 对 照 品 溶 液，按“2. 3”项下方法操作，进样测定，平均浓度( n = 6)为 9. 93 gmL 1 ，SD 为 1. 2% ，表明方法精密度良好。3. 6稳定性取对照品溶液 2 中浓度约为 10 gmL 1 的对 照品溶液，按“2. 3”项下方法操

27、作后，分别于 0、4、9、流 动 相 系 统5 8，结 果 发 现 甲 醇 水( 70 30 )( 80 20) 系统较 好。随着柱温的升高，保 留 时 间 减小，峰形变得尖锐，但为兼顾样品溶液中 Triton X 100 与杂质的分离，选择柱温为 30 。4. 2色谱条件耐用性的考察按照已确定的色谱条件，柱温在 25 35 ，流 速在 0. 8 1. 5 mLmin 1 范围改变，甲醇 水的比 例在 86 14 74 26 之间改变，Triton X 100 色谱峰 峰形均较理想并能与相邻峰良好分离。h 进 样 测 定，峰 面 积 的 SD ( n = 6 )14、30、40为1. 6% ，

28、表明溶液在室温下 40 h 内稳定。3. 7SPE 提取考察3. 7. 1SPE 小 柱 的 选 择Triton X 100 在 反 相4. 3洗脱溶剂的选择Triton X 100 易 溶 于 甲 醇，加 之 流 动 相 为 甲色谱填料上有较强保留 ，能溶于有机溶剂 ，比 较适 合 用 反 相 固相提取小柱进行提取 。 Waters Oa- sis HLB 1 cc 固 相 提 取 小 柱 ，规格较小但又能 实 行 较大浓度的样品 制 备 ，并可直接降低洗脱剂的体 积 ，实现用洗脱剂直接进样 ，减少再次浓缩的工 作 量 。醇 水( 80 20) ，所以选择甲醇为洗脱溶剂。用 同一样品考察了不

29、同比例甲醇的洗脱能力，结果 0% 、5% 、10% 、50% 甲醇未洗脱出 Triton X 100，80% 甲醇能部分洗脱出 Triton X 100，100% 甲醇洗脱能力较 80% 甲醇强。药物分析杂志 Chin J Pharm Anal 2014，34( 7) 1255 5CHEN Ping( 陈平) ，LUO Shan( 罗珊) ，ZHONG Jing( 钟静) ，etal Verification of turbidimetric method for detection of residualTriton X 100 in vaccines( 比 浊法检测疫苗中 Triton X

30、 100残留量的方法学验 证) J Chin J Biol( 中 国 生 物 制 品 学 杂志) ，2012，25( 12) : 1702ZHU Chang qing，ZHENG Hong，LI Dong hui，et al Near infrared hydrophobic probes as molecular light switch for CMCdetermination of Triton X 100 solutionJ Chin J Chem，2004，22( 11) : 1319LIU Xiao yu，LI Ai fang，ZHOU Bao hui，et al Chemilum

31、i-nescence determination of surfactant Triton X 100 in environ-mental water with luminol hydrogen peroxide systemJ ChemCent J，2009，3( 7) : 1LIU Jia( 刘佳) ，ZHANG Qing lin( 张庆林) ，BI Jian jin( 毕建进) ，et al Quantitative analysis of Triton X 100 in plasmidpUDKH by high performance liquid chromatography( 高

32、效 液 相色谱法测定质 粒 pUDKH 中 曲 拉 通 X 100 的 含 量) JChin J Biochem Pharm ( 中 国 生 化 药 物 杂 志 ) ，2004 ，25 ( 4 ) :210DONG Jie( 董洁) ，PAN uo wen( 潘 若 文 ) ，FAN You dang( 范有党) ，et al HPLC determination of Triton X 100 in( split，inactivated) influenza vaccine( 高 效 液 相 色 谱 法 测 定 流 感 病 毒裂解疫苗中 Triton X 100 的 含 量) J Chin

33、J Pharm Anal( 药物分析杂志) ，2011，31( 11) : 2174SHAO Qiu xia( 邵秋霞) ，WANG Mo zheng( 王模正) ，CHENXiang song( 陈祥松) ，et al HPLC determination of Triton X 100 in fibrnogen( 应用液相色 谱法测定纤维中 Triton X 100含量) J Chin J Biol( 中国生物制品学杂志) ，2002，15 ( 1 ) :49YANG Peng yun ( 杨 鹏 云 ) ，CHENG Ya qin ( 程 雅 琴 ) De- termination of

34、 Triton X 100 in methods is established in plasmaproducts( 血浆制品中 Triton X 100 残留量测定方法的建立)J Chin J Biol( 中国生物制品学杂志) ，2003，16( 4) : 235YANG Tie jin( 杨 铁 金) Analytical Samples Pretreatment andSeparation Technologies( 分析样品预处理 及 分 离 技 术) MBeijing( 北京 ) : Chemical Industry Press ( 化学工业出版社 ) ，2007: 289DENG Bo( 邓勃) ，WANG Geng chen( 王庚辰) ，WANG Zheng fan( 汪正范) Analytical Instruments and Instrumental Analysis Con-spectus( 分析仪器与仪器分析概论) M Beijing( 北