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3、化-第二军医大学2003年博士论文尿激酶型纤溶酶原激活剂和肝细胞生长因子联合基因治疗实验性肝纤维化 研究背景及目的 肝纤维化(hepatic fibrosis)是肝脏对慢性损伤的一种修复反应，以细胞外基质(extracellular matrix,ECM)在肝内过多沉积为特征。近年来，针对肝纤维化发生的各个环节，如抑制肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)激活和增殖，减少ECM沉积以及促进肝细胞增殖等方面，设计许多基因治疗方案，为肝纤维化治疗提供了新的手段。 尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinase-typeplasminogen activator,uPA)是调控

4、肝纤维化的重要物质。其活化的双链uPA(two chain uPA,tcuPA)结构可激活纤溶酶原转变为纤溶酶，纤溶酶不但能直接降解ECM，还可将以酶原形式分泌的非活性基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)裂解，切除约10 kDa的片段使之转化为活性状态，活化的MMPs可以切割一种或数种ECM成分，抑制肝纤维化进程。多项研究结果显示，uPA基因删除小鼠可自发出现肝脏、肺脏及其它脏器间质中ECM过多沉积，诱发纤维化形成。 肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)是肝细胞的强效促分裂剂，由链(64 kDa)和链(34 kDa

5、)构成，通过与细胞膜表面特异性c-met受体结合，促进肝细胞增殖；此外，许多研究表明，HGF可以抑制HSC激活和ECM合成，具有一定的抗肝纤维化作用。 复制缺陷型腺病毒是基因治疗肝纤维化广泛使用的基因转移系统，该载体系统具有宿主范围广、可感染分裂期及静止期细胞、包装容量大、不发生整合、繁殖滴度高等优点，在基因治疗研究中得到广泛应用。传统构建重组腺病毒的方法繁琐低效，近年来，He等建立了在大肠杆菌内重组腺病毒的AdEasy(TM)系统，借助细菌内高度有效的同源重组机制并利用抗生素筛选，在短时间内便可得到所需要的重组腺病毒；此外由于在重组同时整合了绿色荧光蛋白(green fluorescent

6、protein,GFP)基因，可以直接观察转染和感染效率，大大方便了腺病毒的重组与鉴定。 本研究选择HGF和uPA作为外源目的基因，利用AdEasy(TM)系统分别构建表达HGF和非分泌型uPA的重组复制缺陷型腺病毒AdHGF和AduPA，通过体外、第二军医大学博士论文中文摘要体内实验研究HGF和uPA联合基因治疗肝纤维化的效果，为多靶点协同治疗肝纤维化提供实验依据。【实验方法】 一、重组复制缺陷型腺病毒AduPA和AdHGF构建及体外表达 分别将HGF和uPA的表达质粒酶切、PCR扩增，获取HGF和uPA cDNA片段。其中在uPA。DNA片段两端分别连接RR固定信号序列和KDEL信号序列进

7、行修饰，使其表达的uPA蛋白两端能分别与内质网膜上的I、n型跨膜蛋白相结合而固定于细胞内，避免uPA大量分泌到细胞外，影响凝血功能。体外连接构建重组穿梭质粒pAdTrack一CMV一HGF和pAdTrack一CMV一ul，A，Pacl酶切线性化后与骨架载体AdEasy一1在大肠杆菌BJS 183内同源重组获得腺病毒质粒pAdHGF和pAduPA，经293细胞包装后得到复制缺陷型重组腺病毒AdHGF和AduPA，同法构建空载病毒AdGFP(无外源基因，仅表达GFP)作为对照病毒。将AdHGF和AduPA分别体外感染肝细胞株L02，以RT一PCR、Northem印迹法和Westem印迹法检测两种病

8、毒在肝细胞中的表达。 二、HGF和uPA基因过表达对细胞生物学特性影响 1.利用AdHGF导入外源HGF基因对肝细胞增殖的影响:分离制备原代培养的Sprague一Dawley(SD)大鼠肝细胞，AdHGF以一定滴度体外感染肝细胞，利用RT一PCR法检测肝细胞HGF和c一met沮GF受体mRNA的表达，ELISA法测定培养上清HGF水平;绘制感染前后细胞增殖曲线;流式细胞仪测定基因导入前后细胞周期变化;免疫细胞荧光法检测HGF基因导入后增殖细胞核抗原(prohferatingeen nuclear antigen，PCNA)表达并计算PcNA指数。 2.利用AduPA导入外源uPA基因对HSC生

9、物学特性的影响:AduPA以一定滴度感染肝星状细胞株HSC一T6，Northem印迹法和免疫细胞化学法检测uPA在Hsc中的表达;EuSA法检测培养上清MMP一2及TGF一pl水平;免疫细胞荧光法测定I、nl型胶原含量的变化。 三、AdHGF和AduPA体内导入对实验性肝纤维化的基因治疗效果:将雄性SD大鼠随机分为6组，每组10只。第1组予橄榄油(3 ml瓜g)皮下注射作为正常对照组;第2一6组为肝纤维化模型组，予40%四氯化碳(CC14)3 ml瓜g皮下注射，3天注射1次，首剂加倍，共注射18次。其中第2组设为模型对照组;第3组为空白病毒AdGFP对照组，于注射CCI;8次后经尾静脉导入4 Xl护pfu AdGFP 2第二军医大学博士论文中文摘要至大鼠体内;第4组设为AdHGF导入组，于注射CC148次后经尾静脉导入2 Xl护pfu AdHGF+2 X 10，pfu AdGFp;第5组为AdupA导入组，于注射eel4s次后经尾静脉导入ZXlogpfuAdul，A+ZXlogpfuAdGF