《过氧化物酶》ppt课件

1、实验二实验二 过氧化物酶活性的测定过氧化物酶活性的测定一、实验目的一、实验目的1.学习红薯过氧化物酶的制备方法。2.掌握过氧化物酶的反响原理及测定方法。二、实验原理二、实验原理 1、过氧化物酶简称POD)简介 过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光协作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。普通老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是由于过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，添加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性添加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理目的。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的

2、重要作用也正在遭到注重。 2酶活力测定酶活力测定 (1) 酶活力酶活力 表示酶量的多少不能像普通物质那样，用分量表示酶量的多少不能像普通物质那样，用分量(g)或体积或体积(ml)。由于酶是一种生物催化剂。酶。由于酶是一种生物催化剂。酶的存在和含量多少应表达在催化才干大小，即的存在和含量多少应表达在催化才干大小，即用酶活力用酶活力(活性活性)表示。表示。 酶活力酶活性指酶催化某一特定化学反响酶活力酶活性指酶催化某一特定化学反响的才干。催化才干强的才干。催化才干强(大大)，酶活力就高，酶活力就高(大大)，也表示酶量多。酶本身的分量不能阐明酶的实也表示酶量多。酶本身的分量不能阐明酶的实践含量多少。同

3、样分量的酶，酶活力可以不同，践含量多少。同样分量的酶，酶活力可以不同，活力高，价值就大。活力高，价值就大。 (2) 酶促反响速度酶促反响速度 酶活力详细用它所催化的某一化学反响的反响速酶活力详细用它所催化的某一化学反响的反响速度来表示，即在最适条件下度来表示，即在最适条件下(最适最适pH、最适、最适T) 酶酶催化的反响速度愈快，酶活力就愈高。速度愈墁，催化的反响速度愈快，酶活力就愈高。速度愈墁，酶的活力就愈低。所以测定酶的活力酶的活力就愈低。所以测定酶的活力(本质上就是本质上就是酶的定量酶的定量)测定就是测定酶促反响的速度测定就是测定酶促反响的速度(用用v表表示示) 。 酶促反响速度可用单位时

4、间内、单位体积中底物酶促反响速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物添加量来表示。单位：浓度的减少量或产物添加量来表示。单位：浓度/单位单位时间时间 常用产物添加量表示，由于它从无到有，变化明常用产物添加量表示，由于它从无到有，变化明显。酶促反响随时间添加，产物添加。显。酶促反响随时间添加，产物添加。 假设将产物浓度对反响时间作图得到酶促反假设将产物浓度对反响时间作图得到酶促反响的速度曲线。响的速度曲线。 Vmax时间时间产产物物的的生生成成量量斜率浓度斜率浓度/时间时间V 从图可知，反响速度只在最初一段时间内坚从图可知，反响速度只在最初一段时间内坚持恒定，随着反响时间的延伸，酶反响速

5、度持恒定，随着反响时间的延伸，酶反响速度逐渐下降。引起下降的缘由很多，如底物浓逐渐下降。引起下降的缘由很多，如底物浓度降低，产物浓度添加而加速了逆反响的进度降低，产物浓度添加而加速了逆反响的进展，产物对酶有抑制造用等。因此研讨酶反展，产物对酶有抑制造用等。因此研讨酶反响速度以酶促反响的初速度为准，即酶促反响速度以酶促反响的初速度为准，即酶促反响最初的一段时间，产物呈线性添加时的反响最初的一段时间，产物呈线性添加时的反响速度。详细指酶促反响速度曲线的斜率。响速度。详细指酶促反响速度曲线的斜率。即从原点对曲线作切线，求切线斜率即从原点对曲线作切线，求切线斜率( v ) = 浓度浓度 / 时间时间

6、由于产物从无到有，只需方法灵敏，可由于产物从无到有，只需方法灵敏，可准确测定。测定产物添加量的方法很多：准确测定。测定产物添加量的方法很多： 化学方法：滴定、比色、气体测压、电化学方法：滴定、比色、气体测压、电化学等。化学等。 物理方法：物理方法：UV吸收、荧光等。吸收、荧光等。 同位素方法等。同位素方法等。 (3) 酶的活力单位酶的活力单位 表示酶活力大小，也就是酶量的大小的单位表示酶活力大小，也就是酶量的大小的单位称酶的活力单位称酶的活力单位(U)。 国际单位国际单位(IU)定义：定义：1个酶活力单位，是指个酶活力单位，是指在特定条件下，在在特定条件下，在1分钟内能转化分钟内能转化1微摩尔

7、微摩尔( mol)底物的酶量，或是转化底物的酶量，或是转化1微摩尔底物微摩尔底物中的有关基团的酶量。中的有关基团的酶量。3、测定原理、测定原理 过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反过氧化物酶催化过氧化氢氧化酚类的反响，产物为醌类化合物，此化合物进一步响，产物为醌类化合物，此化合物进一步缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的缩合或与其他分子缩合，产生颜色较深的化合物。本实验以邻甲氧基苯酚即愈创化合物。本实验以邻甲氧基苯酚即愈创木酚为过氧化物酶的底物，在此酶存在木酚为过氧化物酶的底物，在此酶存在下，下，H2O2可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色可将邻甲氧基苯酚氧化成红棕色的的4-邻甲氧基苯酚，其反响为：邻甲

8、氧基苯酚，其反响为：本实验用紫外吸收法测定产物本实验用紫外吸收法测定产物4邻甲氧基苯酚在邻甲氧基苯酚在470nm光吸收添加值表示产物添加量，划出光吸收光吸收添加值表示产物添加量，划出光吸收 - 时间的速时间的速度曲线，求出曲线的斜率，即酶促反响初速度，再换算度曲线，求出曲线的斜率，即酶促反响初速度，再换算为酶活力。为酶活力。42134567800 2 4 6 8反响时间 分钟生成物光吸收0.400.300.200.102. pH对酶促反响速度的影响对酶促反响速度的影响(1) 影响酶促反响速度的要素影响酶促反响速度的要素* 底物浓度底物浓度 米氏公式米氏公式* 温度温度* 酶浓度酶浓度* 激活剂

9、、抑制剂激活剂、抑制剂* pH (2) pH对酶促反响速度的影响对酶促反响速度的影响 大多数酶的活力受其环境大多数酶的活力受其环境pH影响。这是由影响。这是由于于pH影响底物分子和酶分子中一些基团的影响底物分子和酶分子中一些基团的解离，这些基团的离子化形状关系究竟物解离，这些基团的离子化形状关系究竟物与酶的结合、酶的专注性和酶活性中心的与酶的结合、酶的专注性和酶活性中心的构象。通常各种酶只需在一定构象。通常各种酶只需在一定pH范围内才范围内才具有活性，并在一定具有活性，并在一定pH下，酶促反响具有下，酶促反响具有最大反响速度，此最大反响速度，此pH称最适称最适pH，高于或低，高于或低于此值反响

10、速度都下降。于此值反响速度都下降。 如将反响速度对如将反响速度对pH作曲线，典型的呈钟罩作曲线，典型的呈钟罩形，但不同酶受形，但不同酶受pH影响是不同，所以会有影响是不同，所以会有不同外形，有的只需钟罩形的一半，有的那不同外形，有的只需钟罩形的一半，有的那么是不断线，即受么是不断线，即受pH影响不大。影响不大。木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶胃蛋白酶胃蛋白酶胆碱脂酶胆碱脂酶 不同酶的最适不同酶的最适pH也不同，如胃蛋白酶为也不同，如胃蛋白酶为pH 1.5 - 2.5、胰蛋白酶为、胰蛋白酶为pH 8。但应留意最适。但应留意最适pH不是特征常数，对于同一种酶，其最适不是特征常数，对于同一种酶，其最适pH因底物

11、的种类、浓度及缓冲液成份不同因底物的种类、浓度及缓冲液成份不同而有差别，因此酶的最适而有差别，因此酶的最适pH并不是一个常并不是一个常数，只是在一定条件下才有意义。普通最数，只是在一定条件下才有意义。普通最适适pH在在6 - 8之间。之间。 由于酶活力受由于酶活力受pH影响很大，因此在测定酶影响很大，因此在测定酶活力时，活力时，pH必需恒定，所以测活反响最好必需恒定，所以测活反响最好在缓冲液体系中进展。在缓冲液体系中进展。 本实验测定三亇不同本实验测定三亇不同pH下过氧化物酶的下过氧化物酶的时间光吸收关系曲线，比较三亇不同时间光吸收关系曲线，比较三亇不同pH ( 6.0,7.0,8.0)条件对

12、过氧化物酶活力的条件对过氧化物酶活力的影响。影响。三、实验操作三、实验操作1、过氧化物酶粗品液的制备、过氧化物酶粗品液的制备称取红薯资料称取红薯资料1g，加少许石英砂及，加少许石英砂及0.1mol/LpH=6.0磷酸缓冲液磷酸缓冲液2ml左右左右) ，于研钵中研磨成匀浆。于研钵中研磨成匀浆。再参与再参与3ml磷酸缓冲液浸提磷酸缓冲液浸提20分钟后，以分钟后，以6000r/min离心离心15分钟。分钟。倾出上清液并过滤，然后转入倾出上清液并过滤，然后转入10ml容量瓶容量瓶定容，摇匀后，贮于冷处备用。定容，摇匀后，贮于冷处备用。 2、 酶活力测定酶活力测定 (1)取取1只比色杯洗净控干，按以下步

13、骤操作：只比色杯洗净控干，按以下步骤操作： 用移液管汲取用移液管汲取0.1 mol/L反响液反响液(pH 6.0) 2.9mL 参与比色杯中。参与比色杯中。 放入紫外分光光度计比色杯架内，按放入紫外分光光度计比色杯架内，按auto zero，出现插入空白，按出现插入空白，按ok，仪器自动调零。调零完，仪器自动调零。调零完成后按成后按start，出现插入样品。，出现插入样品。 (2)取出比色杯，取出比色杯，1人加酶液人加酶液(L)，先加，先加20 L ，另另1人同时按人同时按ok开场计时，加酶后盖上硫酸纸，开场计时，加酶后盖上硫酸纸，按紧混匀，按紧混匀，30秒内放入比色杯架内，仪器每秒内放入比色

14、杯架内，仪器每30秒自动记录光吸收值秒自动记录光吸收值A470nm。 (3)按数据处置中的数据打印，显示按数据处置中的数据打印，显示8个数据，个数据，记录数据。记录数据。 (4)操作要点：操作要点： * 关键是酶稀释的倍数和酶量多少要适宜，关键是酶稀释的倍数和酶量多少要适宜，使使A470nm在在0.20.4/min，即第，即第1个个30秒秒A470nm在在0.1- 0.2。过低过高都应添加或减。过低过高都应添加或减少酶量重新做。少酶量重新做。 * 加酶后应迅速摇匀，立刻计算时间，加酶后应迅速摇匀，立刻计算时间，2人人要配合好，计时不能提早或推后，否那么要配合好，计时不能提早或推后，否那么曲线不

15、是从原点开场。曲线不是从原点开场。 * 每次测定前务必洗净比色杯，用去离子水每次测定前务必洗净比色杯，用去离子水冲洗冲洗5遍以上，保证不残留上次的溶液，否遍以上，保证不残留上次的溶液，否那么影响测定。那么影响测定。四四. 数据处置数据处置 1. 用坐标纸作出时间用坐标纸作出时间 A470nm曲线，过原曲线，过原点在直线部分作切线，求斜率点在直线部分作切线，求斜率A470nm /min 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 时间时间/min 10.80.60.40.2A470nm 2. 代入下式计算酶活力代入下式计算酶活力 A470nm /minV POD活力单位活力单

16、位mol/min= L A470nm /min3 mL = 26.6 mL/ mol cmcm A470nm 3 = (mol/min) 26.6 V 反响液体积反响液体积 ( mL ) 产物产物4邻甲氧基苯酚的摩尔消光系数邻甲氧基苯酚的摩尔消光系数26.6 L/ mmolcm 即即26.6 mL/ molcm) L 比色杯光径比色杯光径 (1cm)实验三实验三 POD蛋白浓度测定蛋白浓度测定 和比活力计算和比活力计算 一一.实验目的实验目的 1.学习学习Folin酚法酚法Lowry法测法测定定POD蛋白浓度的原理和方法蛋白浓度的原理和方法 2.掌握比活力计算方法掌握比活力计算方法二二.实验原

17、理实验原理1Folin酚法原理酚法原理 Folin酚试剂由两种试剂组成：酚试剂由两种试剂组成： 甲试剂：双缩脲试剂甲试剂：双缩脲试剂 尿素加热至尿素加热至180左右，两分子尿素缩左右，两分子尿素缩合放出一分子氨，而构成双缩脲。合放出一分子氨，而构成双缩脲。 NH2 NH2 C = O C = O NH2 180 NH + NH3 NH2 C = O C = O NH2 NH2 双缩脲在碱性溶液中与铜离子酒双缩脲在碱性溶液中与铜离子酒石酸钾钠石酸钾钠-CuSO4络合生成复杂络合生成复杂的紫红色化合物。的紫红色化合物。 蛋白质分子中的肽键蛋白质分子中的肽键CONH与双缩脲构造类似，也有与双缩脲构造

18、类似，也有双缩脲反响，其颜色深浅与蛋白质双缩脲反响，其颜色深浅与蛋白质的含量成正比，因此一切蛋白质或的含量成正比，因此一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反响，二肽以上的多肽都有双缩脲反响，可用作蛋白质定性、定量分析。可用作蛋白质定性、定量分析。 甲试剂本质是利用蛋白质中肽甲试剂本质是利用蛋白质中肽键反响进展定量测定，它与蛋键反响进展定量测定，它与蛋白质分子量及氨基酸组成无关，白质分子量及氨基酸组成无关，即受蛋白质氨基酸的特异性影即受蛋白质氨基酸的特异性影响较少。但灵敏度较低，响较少。但灵敏度较低，mg级级程度，程度，010 mg/mL作规范曲线。作规范曲线。 乙试剂：主要起作用是磷钼酸磷钨酸

19、，它由钼酸钠乙试剂：主要起作用是磷钼酸磷钨酸，它由钼酸钠钨酸钠在酸性磷酸等作用下产生。钨酸钠在酸性磷酸等作用下产生。 钼酸钠钨酸钠钼酸钠钨酸钠 HCl 碱性碱性 H3PO4 + 钼酸钨酸钼酸钨酸 磷钼酸磷钼酸 钼兰钨兰钼兰钨兰 磷钨酸复原剂磷钨酸复原剂 H3PO4 + 12H2MoO4 H3Mo12PO40 + 12H2O 碱性复原剂 Mo2O3MoO3 兰色 Folin酚试剂最初由Folin等于1912年提出，当时只需乙试剂运用于酚类测定，以后才用于蛋白质测定。由于Tyr的酚基也能起复原剂作用，呈兰色反响，因此被利用于测定蛋白质，产物颜色深浅与被测蛋白质含量成正比关系，所以乙试剂作用是利用蛋

20、白质中Tyr、Try、Cys等具有复原性的氨基酸残基的作用进展测定，灵敏度高，但是后来发现有些缺陷，出现不少改良方法。 1951年年Lowry劳里在劳里在 Folin酚试剂酚试剂 中引入双缩脲反响参与甲试剂即成中引入双缩脲反响参与甲试剂即成为如今广泛被运用的为如今广泛被运用的Lowry法。法。 为什么要作这样改良？为什么要作这样改良？ Folin酚试剂中只需乙试剂，依赖蛋白质酚试剂中只需乙试剂，依赖蛋白质中中Tyr、Trp等氨基酸残基的反响，而对等氨基酸残基的反响，而对于不同种类蛋白质，由于它们之间的氨于不同种类蛋白质，由于它们之间的氨基酸组成不同，在呈色反响中就会有差基酸组成不同，在呈色反响

21、中就会有差别，影响实验准确度，即受蛋白质特性别，影响实验准确度，即受蛋白质特性影响较大，而双缩脲试剂是利用肽键反影响较大，而双缩脲试剂是利用肽键反响，不受氨基酸组成的影响。响，不受氨基酸组成的影响。 引入双缩脲试剂后，具有两种试剂双重引入双缩脲试剂后，具有两种试剂双重作用，相互补充，结果大大添加了反作用，相互补充，结果大大添加了反响的灵敏度和准确度。响的灵敏度和准确度。Lowry法较双缩法较双缩脲灵敏度提高脲灵敏度提高100倍，较倍，较UV法灵敏法灵敏1020倍。倍。 Folin酚酚Lowry法，灵敏度高，操法，灵敏度高，操作简单，迅速，不需求特殊仪器，常作简单，迅速，不需求特殊仪器，常用作蛋

22、白质定量测定，文献援用最多。用作蛋白质定量测定，文献援用最多。 方法方法 灵敏度灵敏度 时间时间 原理原理 干扰物质干扰物质 阐明阐明凯氏定氮法凯氏定氮法Kjedahl法法灵敏度低，适灵敏度低，适用于用于0.21.0mg/ml氮，误差为氮，误差为 2费时费时 810小时小时蛋白质平均含氮蛋白质平均含氮量量16经过硫酸经过硫酸消化，强碱碱化，消化，强碱碱化，吸收并滴定，准确吸收并滴定，准确测定氮量测定氮量非蛋白氮可用非蛋白氮可用三氯乙酸沉淀蛋三氯乙酸沉淀蛋白质而分别白质而分别用于规范蛋白质用于规范蛋白质含量的准确测含量的准确测定；干扰少；费定；干扰少；费时太长时太长双缩脲法双缩脲法Biuret法

23、法灵敏度低灵敏度低310nm比色比色0.11.0mg/ml540nm比色比色110mg/ml中速中速 2030分钟分钟多肽键碱性多肽键碱性Cu2紫色络合紫色络合物物硫酸铵；硫酸铵；Tris缓冲液；缓冲液；某些氨基酸某些氨基酸用于快速测定，用于快速测定，但不太灵敏；不但不太灵敏；不同蛋白质显色相同蛋白质显色相似似紫外吸收法紫外吸收法较为灵敏较为灵敏0.11.0mg/ml快速快速 510分钟分钟蛋白质中的酪氨酸蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在和色氨酸残基在280nm处的光吸收处的光吸收各种嘌吟和嘧各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸啶；各种核苷酸用于层析柱流出用于层析柱流出液的检测；核酸液的检测；核酸的吸收可

24、以校正的吸收可以校正Folin酚试剂酚试剂法法Lowry法法灵敏度高灵敏度高0.035g慢速慢速 4060分钟分钟双缩脲反响；磷钼双缩脲反响；磷钼酸磷钨酸试剂被酸磷钨酸试剂被Tyr和和Phe复原复原硫酸铵；硫酸铵；Tris缓冲液；缓冲液；甘氨酸；甘氨酸；各种硫醇各种硫醇耗费时间长；操耗费时间长；操作要严厉计时；作要严厉计时；颜色深浅随不同颜色深浅随不同蛋白量变化蛋白量变化考马斯亮蓝法考马斯亮蓝法(Bradford法法)灵敏度最高灵敏度最高15g快速快速515分钟分钟考马斯亮蓝染料与考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其蛋白质结合时，其max由由465nm变变为为595nm强碱性缓冲液；强碱性缓冲液；

25、TritonX-100;SDS 最好的方法；最好的方法； 干扰物质少；干扰物质少； 颜色稳定；颜色稳定； 颜色深浅随不同颜色深浅随不同蛋白量变化蛋白量变化2、蛋白质的定量测定、蛋白质的定量测定 3.比活力概念比活力概念 比较不同分量或不同蛋白含量的酶活力并无实践比较不同分量或不同蛋白含量的酶活力并无实践意义，不同酶或同一种酶在不同情况下的比较应意义，不同酶或同一种酶在不同情况下的比较应有一个分量规范，于是产生出另一个酶的重要参有一个分量规范，于是产生出另一个酶的重要参数数比活力。比活力。 比活力比活力 指单位质量的酶蛋白所具有的酶活力指单位质量的酶蛋白所具有的酶活力 单位单位 酶活力单位酶活力

26、单位 / mg酶蛋白酶蛋白 ( IU / mg酶蛋酶蛋白白 ) 比活力是酶学研讨及酶制剂消费制备中经常运用比活力是酶学研讨及酶制剂消费制备中经常运用的数据，用来比较单位分量酶蛋白的催化才干的数据，用来比较单位分量酶蛋白的催化才干( 即即酶活力大小酶活力大小 )。 比活力实践意义比活力实践意义 可以阐明酶的质量好坏，纯度高可以阐明酶的质量好坏，纯度高低。不同酶比较时，比活力高，阐明其质量好，低。不同酶比较时，比活力高，阐明其质量好，纯度高；对同一种酶，可以比较不同批次的质量纯度高；对同一种酶，可以比较不同批次的质量和纯度。在酶的消费制备过程，调查比活力尤为和纯度。在酶的消费制备过程，调查比活力尤

27、为重要，随着该酶不断被提纯，它的比活力升高，重要，随着该酶不断被提纯，它的比活力升高，阐明酶逐渐被纯化，比如，粗制品总活力很高，阐明酶逐渐被纯化，比如，粗制品总活力很高，蛋白质含量也很高蛋白质含量也很高(杂蛋白多杂蛋白多)，比活力低。纯化后，比活力低。纯化后虽然总活力降低，但蛋白质含量也因大量杂蛋白虽然总活力降低，但蛋白质含量也因大量杂蛋白被除去而减少，使比活力升高。酶愈纯，比活力被除去而减少，使比活力升高。酶愈纯，比活力愈高，比活力不再升高，酶就相当纯了，因此比愈高，比活力不再升高，酶就相当纯了，因此比活力用以衡量消费工艺优劣、消费效率高低。它活力用以衡量消费工艺优劣、消费效率高低。它是一个

28、很有实践用途的参数，是经常要测定的数是一个很有实践用途的参数，是经常要测定的数据。据。三、操作步骤三、操作步骤每人取每人取16支试管，按下表平行支试管，按下表平行操作：操作：12345678规范蛋白质溶液规范蛋白质溶液/mL 00.10.20.30.40.5待测蛋白质溶液待测蛋白质溶液/mL 0.030.05dH2O/mL0.50.40.30.20.100.470.45甲试剂甲试剂/mL /mL 2.52.52.52.52.52.52.52.5混匀，于室温放置混匀，于室温放置10min 10min 乙试剂乙试剂/mL /mL 0.250.250.250.250.250.250.250.25迅速混匀，室温放置迅速混匀，室温放置30min30min后，以后，以dH2OdH2O为空白，在为空白，在640nm640nm处比色处比色 A640nm(1) A640nm (2) A640nm * 规范蛋白质溶液为牛血清清蛋白规范蛋白质溶液为牛血清清蛋白 ( 150g/mL )。* 侍测样品侍测样品x为为POD酶原液，悄然倒置摇匀后酶原液，悄然倒置摇匀后用